Bio Technical フォーラム

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FACS　細胞内染色 トピック削除
No.3516-TOPIC - 2014/11/06 (木) 07:26:33 - KA
フローサイトメトリー初心者です。

pSmad2/3を染色しようとしておりますが、TGF-b1刺激・未刺激細胞とも全くシグナルに違いがなく、困っております。TGF-b1刺激が必要なCD103分子の発現は、しっかり認められているので、Smadを介したシグナルは伝達されているものと思います。

よって、染色が悪いのではないかと思いまして、染色抗体量を増やすなどしておりますが、イマイチです。細胞透過処理をしたのち、4C、1時間で染色しました。

4C　overnightで染色するというのは、間違ったやり方でしょうか？
　
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(無題) 削除/引用
No.3516-7 - 2014/11/07 (金) 13:03:23 - おお
>[Re:1] KAさんは書きました :
> ...しっかり認められているので、Smadを介したシグナルは伝達されているものと思います。

どれほど当てになるのでしょうか。。。上がっているということがはっきりわかっている実験系であればポジティブコントロールになるし、手技が悪いのか細胞のリスポンスが余りよくないのかというのがはっきりすると思いますが。

あとリン酸化して核移行するんでしたっけ。細胞質より核の方が抗体がアクセスしにくそうなので、、、核にいったが抗体の反応が細胞質よりも今イチでリン酸化フォームの量をうまく反映してないとか。。。

(無題) 削除/引用
No.3516-6 - 2014/11/07 (金) 12:54:35 - おお
WBではだめなんですか?

(無題) 削除/引用
No.3516-5 - 2014/11/07 (金) 11:03:53 - HIH
いずれの試薬も詳細な成分が公開されているわけではないので具体的な違いは分かりませんが、少なくともBD PhosflowのKitがリン酸化解析に最適化されていることは確かです。おそらくホスファターゼ阻害剤等も含まれていると思います。

eBioの固定Kitを使っていて推奨プロトコルがPermIIIということなのでリンパ球などを扱っているのかと思いますが実際にリン酸化のFACSをやってみてもeBioのKitでは全く染まらないものもBD PhosFlowを使うことで染まることがほとんどです。

FACS　細胞内染色 削除/引用
No.3516-4 - 2014/11/07 (金) 05:22:47 - KA
回答ありがとうございます。
固定・可溶化には、eBioscienceのFoxp3/Transcription Factor Staining Buffer S
etを用い、抗体はBD Phosflowを用いています。BDの説明書には、固定・可溶化試薬にはLyse/Fix、PermIIIを使うよう、書いてありますが、当ラボにある上記eBioのものを取り敢えず使ってみたといった感じです。

BDの試薬とeBioの試薬では、なにが違うのでしょうか。

(無題) 削除/引用
No.3516-3 - 2014/11/06 (木) 16:04:13 - HIH
まず大前提としてリン酸化のFCM解析はかなり条件設定が適切でないと特異的な染色が得られないことが多いです。

固定・可溶化に用いている試薬・Kit等はどのようなものでしょうか？
また抗体はFCM解析に使用可能なものでしょうか？

BDのPhosFlow抗体およびKitなら細胞に応じて固定試薬を選択することも可能なのでお勧めです。

加えてTGFシグナルなら刺激後からの時間も重要なので５分後から継時的に観察する必要があるかと思いますが…

(無題) 削除/引用
No.3516-2 - 2014/11/06 (木) 10:21:51 - alpha
透過処理が不十分ということはありませんか？

FACS　細胞内染色 削除/引用
No.3516-1 - 2014/11/06 (木) 07:26:33 - KA
フローサイトメトリー初心者です。

pSmad2/3を染色しようとしておりますが、TGF-b1刺激・未刺激細胞とも全くシグナルに違いがなく、困っております。TGF-b1刺激が必要なCD103分子の発現は、しっかり認められているので、Smadを介したシグナルは伝達されているものと思います。

よって、染色が悪いのではないかと思いまして、染色抗体量を増やすなどしておりますが、イマイチです。細胞透過処理をしたのち、4C、1時間で染色しました。

4C　overnightで染色するというのは、間違ったやり方でしょうか？
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