いつも参考にさせていただいております。
読みにくい点などございましたら申し訳ありません。
現在マウスES細胞から取得したcDNAを用いてqPCRを行い、mRNAの発現量を検討しております。
用いている試薬はKAPA SYBR FAST qPCRキットです。
ここ1ヶ月ほど以下の問題が発生しており困っております。
・検量線が上手く引けない
増殖曲線を見ますと、薄い希釈系の方が濃い希釈系よりも先に立ち上がってきてしまうことがままあります。
・ネガコンとして用いている水の立ちあがりが非常に速い
対策として
・プライマーの再希釈（100μM→10μM）2回
・水の作り直し 2回
・可能な限りラージスケールでの希釈（12μの水に対し4μのサンプルを加え希釈）
・希釈時数度ボルテックス
・グローブをはめて操作
・先輩と一緒に実験を行い操作の確認
・同じ機種（ABI 7500）だが別の機器を使用
・使用するキットの試薬およびチップの交換
等行いましたが改善しません。
Dissociation curveを見る限り、ピークは1つでプライマーダイマーの形成はありません。
（水はサンプルと同じ位置にピークが出てしまいますが…。）
増殖曲線の立ち上がりの位置も大方20前後で、サンプルが薄すぎるというわけでもなさそうです。
吸着も考えましたが、cDNA取得後すぐqPCRを行っても改善されません。
何か不足の点がありましたらご指摘願います。
どうぞ、よろしくお願いいたします。 |
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