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(無題) 削除/引用 No.3545-14 - 2014/11/15 (土) 10:29:21 - mon PBS/EDTAは市販もVerseneという名称で販売されていますが、自作で十分です。 2%(w/v)EDTA-Na(pH調整は不要）をオートクレーブして、1/100量をD-PBSに添加するだけです。 今回提案した方法は、トリプシン処理したdish中の細胞を培地でなくPBS/EDTA(+0.1%FBS)で回収し、遠心して上清を除去、目的量の培地に一気に懸濁して、凝集する前に播種する、というものです。 FBSは遠心時の管壁への吸着を防ぐ目的で加えますが、Ca源ですので、BSAの方がよいかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.3545-13 - 2014/11/15 (土) 08:10:42 - 大きな木 >[Re:11] monさんは書きました : > 培地成分(Ca++?)が悪さするとしたら、 > PBS, PBS+EDTA,もしくはそれらに+0.1%FBSほど添加した溶液で回収・遠心し、上清を除去して、たたくださんの提案のように一気に培地に懸濁したらいかがでしょうか。 ありがとうございます ちなみに、 PBS+EDTA,ってプレミックスが市販されているのでしょうか？ ご教示お願い致します。 作業としては、トリプシンではがして➡︎15mlのチューブで10%FBS DMEMに分散(トリプシン中和)➡︎遠心➡︎上澄み吸引➡︎この段階でチューブの先端をタッピング(目に見える塊がないことを確認)➡︎10%FBS DMEMを10ml添加➡︎チューブ内でピペッティング➡︎ビルケルチュルク上dwみたときクラスターが残っているといった状況です。 ご紹介頂いた液はどの段階DMEM 使用するのが良いのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3545-12 - 2014/11/15 (土) 07:54:36 - 大きな木 >[Re:11] monさんは書きました : > 培地成分(Ca++?)が悪さするとしたら、 > PBS, PBS+EDTA,もしくはそれらに+0.1%FBSほど添加した溶液で回収・遠心し、上清を除去して、たたくださんの提案のように一気に培地に懸濁したらいかがでしょうか。 ありがとうございます。この方法っって、よくやられている方法なのでしょうか？ ちなみに、pbs+えdたのプレミックスは市販品があるのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3545-11 - 2014/11/15 (土) 07:39:52 - mon 培地成分(Ca++?)が悪さするとしたら、 PBS, PBS+EDTA,もしくはそれらに+0.1%FBSほど添加した溶液で回収・遠心し、上清を除去して、たたくださんの提案のように一気に培地に懸濁したらいかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.3545-10 - 2014/11/14 (金) 22:38:35 - 大きな木 目に見える大きさのかたまは崩れたのですが、細胞１０個くらいの小さなクラスターみたいなものがほぐせませんでした。なぜかクラスターが残ったままでした。

(無題) 削除/引用 No.3545-9 - 2014/11/14 (金) 14:11:31 - たたくだ 遠心後、上澄みを除去してペレットにしますよね。ペレット状態から一気に大目の培地を入れると、うまくほぐれずにチューブ内でかたまりのままでいることがあります。培地を入れる前にチューブの底をたたいてペレットをほぐしてから培地を入れるとピペッティングで細胞をミックスしやすいですよ。

(無題) 削除/引用 No.3545-8 - 2014/11/14 (金) 13:49:05 - 774R 遠心しないで、そのままディッシュに撒いて、（必要なら）張り付いてから培地交換するというのではダメですか？ 自分のところは、継代するときは遠心すらしないでトリプシン入ったままの培地でやってますよ。HEK、CHO、HeLa等では問題ないですね。

(無題) 削除/引用 No.3545-7 - 2014/11/14 (金) 13:30:25 - qw ＞トリプシンではがしたときはきれいにバラバラに トリプシンではがし血清入り培地で懸濁したあともきれいにバラバラになっていましたか？ そのあとで遠心したら、うまく行くのではないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3545-6 - 2014/11/14 (金) 13:09:45 - yyy 220gだとそれ程大きいわけではないですね。stickyな細胞なのでしょうか？ 継代用でなければ回収してから直ぐにon iceにして遠心も冷却すればほぐしやすい場合もありますが、継代する場合にはやりたくないですね。 件のウェブサイトの方法の中では、細胞が機械的刺激に十分強いなら、ピペットの先に黄色チップをつけるのが効きそうな気もしますが、どれも実際にやったことが無いのでなんとも言えません。

(無題) 削除/引用 No.3545-5 - 2014/11/14 (金) 09:41:54 - 大きな木 ローターの換算表をみみると220gです。 http://www.toyobo.co.jp/seihin/xr/lifescience/tech/reader/story/ のようなものがあるようなのですが、いかがでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3545-4 - 2014/11/14 (金) 09:02:28 - yyy 今気づきましたが…rcfではなくて1000rpmだったんですね。 質問主さんの使ってるローターサイズが不明ですが、まあ、参考までに

(無題) 削除/引用 No.3545-3 - 2014/11/14 (金) 09:00:21 - yyy 培養細胞の遠心で1000xgというのが多いみたいですが、個人的にいつも100xgでやっています。 正式にどの程度落ちてるか調べたことはありませんが、少なくとも自分が使ってる細胞に関しては、上清のクリア具合から察するに落ちるべきものは殆ど全て落ちていると思うので、それ以上にrcfを大きくする理由が無いからです。 大きな木さんの細胞でも同じとは限りませんが、15ml-コニカルチューブで100-200xgだとペレットはかなり緩いので簡単に再懸濁出来ると思いますよ。

(無題) 削除/引用 No.3545-2 - 2014/11/14 (金) 08:44:56 - え？ これはラボ内の他の人に聞くべき質問。 質問の内容から同じ細胞を扱っている人がいないとは考えられない。

hMSC 遠心後 ペレットが解れません 削除/引用 No.3545-1 - 2014/11/14 (金) 08:17:14 - 大きな木 継代するときに、トリプシンではがしたときはきれいにバラバラになっていたのですが、血清入り培地で遠心1000rpm、5minしたら、ペレットが何度ピペッティングしても解れません。何か解す良い方法はございませんでしょうか？

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