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ありがとうございます。 削除/引用 No.3651-10 - 2014/12/12 (金) 18:09:08 - はる 台風一家様 ご連絡ありがとうございます。 私も途中からフィーダーフリーにする方法が、一番いいのではないかと思っていました。 継代数３まではEpiSCの様の形態になるのですが、その先が維持できません。 なので継代数３からフィーダーフリーにすればうまくいくかもしれません。 ESからのEpiSC誘導の難しい点は、分化細胞が増える点と、ES細胞のままのような細胞が増える点だと思います。 実際にやってみます。

(無題) 削除/引用 No.3651-8 - 2014/12/12 (金) 17:43:40 - 台風一家 EpiSCは、分化したESをコントロールとして使いたかっただけなので、 手っ取り早くMEF上で分化させました (^^; だけど、ESを分化させるのにMEFって必要なのかなと当時疑問に思って いたのも事実です(MEFはESの未分化を維持する役割なので)。 私は試していないのですが、ヒトESはマトリゲルで培養可能なので、 最初はMEFで培養しておいて、途中からマトリゲルに切り替えるってのも ありなのかなあと思いました。 そのあたりは実際に試したことがないので何とも言えませんが…。 たしかにFCSコートで培養している論文もありますね。 なにもMEFにこだわる必要はないと個人的に思いました。 EpiSCに関して専門にやってないもので、ごめんなさい。

MEF上での誘導に関して 削除/引用 No.3651-7 - 2014/12/12 (金) 16:13:05 - はる 台風一家様 ご丁寧に詳細を記載していただき、とても参考になります。 ありがとうございます。 やはりActivinAが必要ではないかと思ってきました。 どれくらいの量かは知りませんが、MEFがActivinAを分泌するのでその分だけで補えるのではないかと都合よく思っていました。ActivinAの濃度が重要なのかもしれません。 話は少し変わりますが、ES細胞からのEpiSCへの誘導に用いるdishの接着因子は、大きく分けてフィブロネクチンかMEFの２択だと思います（他にもFCSコート、ゼラチン、オルニチンなどがありますが）。台風一家様は、EpiSCへの誘導に用いるdishの接着因子に関してどのようなご意見をお持ちでしょうか。 現在、MEF上で誘導していますが、MEFからはLIFも分泌するため、EpiSC誘導にはあまり良くないかもしれないと思ってきました。（Embryo-EpiSC樹立時に抗LIF抗体をMEFに加える方もいるので）

(無題) 削除/引用 No.3651-6 - 2014/12/12 (金) 14:05:55 - 台風一家 2i/LIFで樹立したES細胞をEpiSCに分化させました。 継代を続けると分化能に影響がでるかと思い、若い継代数のものを分化させました。 参考にした論文は、Ludovic Vallierが2007年にNatureに出した論文です。 確かに、Activinは安価ではありません。 Activinを使わない論文もいくつかありますが、Activinを入れなくて良い 理由が分からなかったので、Activinを入れました。 この系で培養すると、ヒトESライクな形態になりました。 FGF5、GATA4、Tなどの発現も、ESに比べ何十〜何百倍にも増えました。 私も20% KSRも、コラゲナーゼも使っているので、そのあたりの条件は同じだと 思います。 どうしてもテクニカルな面も含まれてくるかとは思いますが、参考になれば 幸いです。

ご返信ありがとうございます。 削除/引用 No.3651-5 - 2014/12/12 (金) 13:23:45 - はる おお様 使用しているマウスES細胞（R1株）は、2i/LIF応答性、未分化マーカーの発現、ALP染色、EB形成による分化マーカーの発現解析の結果、ES細胞は未分化性・多能性があると言えます。やはり2i/LIFからEpiSCを開始すべきなのかもしれません。 台風一家様 当初はActivinAを使用していましたが、うまくいきませんでした。（オースティン・スミス研究室の方法） また、近年EpiSC関連の論文においてMEF上でbFGFのみで誘導しているものがいくつかあり、且つ、所属する研究室が貧乏なのでActivinAを使わなくてもいいなら、そちらの方が嬉しいという理由です。 台風一家様はどのような条件で成功されていますか。やはりActivinAが必要なのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.3651-4 - 2014/12/12 (金) 12:22:13 - 台風一家 Activin Aを使わなかった理由は？

(無題) 削除/引用 No.3651-2 - 2014/12/12 (金) 09:22:03 - おお つかっているESがもとのものから変化してしまっているとかその辺は疑う余地がありませんか?

mES細胞からのEpiSCへの誘導 削除/引用 No.3651-1 - 2014/12/11 (木) 13:34:24 - はる マウスES細胞（2i/LIFではない）から、ｍEpiSC（マウスエピブラスト幹細胞）を誘導したいのですが上手くいきません。 EpiSCの誘導できたかどうかは、リアルタイムPCR解析により、 FGF5とOtx2の増加 Klf4、Rex1とNanogの減少 Oct4の発現が変化しない という3点で判断しています。 DMEM/F12に20% KSR、neaa、2-MEなどを入れた培地を使っています。（N2B27培地ではない） その培地にｂFGF10ng/ml加え、MEF上で誘導をしています。 ActivinAは使用していません。 継代にはコラゲナーゼとスクレーパーを使用しています。 上手くいっている方がいましたら、どのようにすれば上手くいくのか（コツ？）を教えていただきたいです。

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