BioTechnicalフォーラム [ラボが変わると組み換えタンパク質の誘導量が激減]

ラボが変わると組み換えタンパク質の誘導量が激減

No.366-TOPIC - 2012/04/05 (木) 10:48:51 - PP

大腸菌を使った組み換えタンパク質の誘導について教えてください。
留学先のラボからコンストラクトを持ち帰り、日本のラボで全く同じ方法で誘導精製しました。
その結果、日本のラボで誘導精製したタンパクは留学先で誘導精製したものの1/10量ほどしかありませんでした。
試薬類は出来る限り同じ物を使用しているのですが、IPTGだけ留学先ではFisherのものでこちらではWakoのものです。あと気になる点は振盪器ですが、IPTGや振盪器（エアレーション）で発現量が1/10になったりするものでしょうか？
具体的な方法としては
１LのLBで３時間大腸菌（Rosetta2）を培養
IPTG（終濃度1mM)を添加してさらに３時間培養
遠心集菌
超音波破砕
遠心して沈殿をTrito-X, DTT, EDTAを含むバッファーで洗浄（封入体精製）
洗浄後の沈殿を８M尿素で可溶化しTalonで精製（His-tagです）
です。
ご意見や同様の経験があれば教えてください。
　

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No.366-7 - 2012/04/06 (金) 08:39:44 - Harmonia

発現ベクターの変異とか？
「変異率はそんなに高くないし、全体に広がる分けない！！」
と思われるでしょうが、こういう場合はどうでしょう？

留学先からクローンのDNA溶液を持ち帰った。
少ないから大腸菌で形質転換して増やした。
もちろんシングルコロニーを取った。
その結果、「たまたま」変異の入ったクローンを拾っていた。

（倉光先生の書き物に、培養に関してはヒントがあったような？）

(無題)

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No.366-6 - 2012/04/05 (木) 16:20:48 - さく

水が変わるとダメという話を聞いたことがあります。微量元素の違いではないかとか。ミリQを使っていたのであればあまり変わらないかもしれませんが。

(無題)

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No.366-5 - 2012/04/05 (木) 15:27:47 - PP

皆様

レスありがとうございます。
今まで留学先でいくつもタンパク質を誘導してきましたが、そこまでセンシティブなものだとは思っていませんでした。一度条件を検討しなおしてみたいと思います。

(無題)

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No.366-4 - 2012/04/05 (木) 12:50:35 - 病は気から

えっと、ラボが変わって全く同じってことがあり得ないと思いますが、
スレ主さんが書いているように IPTG が違うとか。
もさんが書いているように、機器の違いであったり。
他にも大腸菌を輸送しているときの条件によっては、性質が変わったり。
ミリＱ水などもメンテの有無によっては、要求性能を満たしていないかもしれなせん。

ここは考え方を変えて、
留学先に最適化された条件で、日本でも発現量が1/10もあった。
と考えた方が精神衛生上よろしいかと

(無題)

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No.366-3 - 2012/04/05 (木) 11:49:31 - う

培養条件とかでなく、大腸菌自体がおかしいのではないでしょうか。

(無題)

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No.366-2 - 2012/04/05 (木) 11:31:12 - も

振とう機の動きや培養器具の形状でエアレーションは結構変わるし、温度も怪しい、前培養の状態や初期接種量もコントロールしづらい、、、とくれば１０倍違ってもおかしくないですよ。そんなものです。現状の環境で、再度、培養パラメータを最適化するか１０倍サイズ実験にするかはお好みです。IPTGのメーカーの差は検討の優先順位としてはかなり後ろのほうになります。

ラボが変わると組み換えタンパク質の誘導量が激減

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No.366-1 - 2012/04/05 (木) 10:48:51 - PP

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