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(無題) 削除/引用 No.370-7 - 2012/04/06 (金) 20:24:05 - Harmonia BACライブラリーにはない領域 の根拠は？ その遺伝子が丸ごとへテロクロマチン領域にあって解析がなされてないとか、BACのインサート長をさらに超えるリピートだけの遺伝子とかなら、無いと言い切れるだろうけど。 探し方が悪いのではなく、「ない」といえる根拠は？

(無題) 削除/引用 No.370-6 - 2012/04/06 (金) 12:37:49 - AP ~さんのコメントは納得です。 特に >ゲノミックライブラリーの作製→コロハイ等でスクリーニングはできませんかね。 は、温故知新、灯台下暗し。 ライブラリーから取れたクローンのなかにCTリピートみたいのはかなり普通にみられるので、それで大腸菌が生えてこないということもないと思うのですが（もちろん、大きめのinverted repeatのように組換えで欠失しやすかったり、致死になったりする例はありますが）。だったら、CTリピートのPCR産物でもクローニングできるだろうという話に戻ってしまいますが。ピリミジンばかりなのでUV被爆によるダイマー形成に非常に敏感だとか？

transformation-associated recombination cloning 削除/引用 No.370-5 - 2012/04/06 (金) 12:21:47 - 弘法 酵母を用いたtransformation-associated recombination cloningはいかがでしょうか？ Selective isolation of genomic loci from complex genomes by transformation-associated recombination cloning in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Kouprina N, Larionov V. Nat Protoc. 2008;3(3):371-7. PMID: 18323808

(無題) 削除/引用 No.370-4 - 2012/04/06 (金) 10:53:24 - ~ 大腸菌株の情報が書かれていませんが、 SuReやStblシリーズなどの組換えが起こりにくい株を使う方がいいと思います。 ただ、PCRを経ると、リピート数が変わったクローンが取れてしまうかもしれませんね。 プロモーターであれば近傍配列の情報はあるでしょうから、 ゲノミックライブラリーの作製→コロハイ等でスクリーニング はできませんかね。

(無題) 削除/引用 No.370-3 - 2012/04/05 (木) 22:29:20 - T.K BACライブラリーにはない領域なので、それもできる状況ではないと思われます。 結果としてLucも行いたいので、pblueだけでなく様々なベクターに組み込めるような手法、たとえば自分で調べた範囲だと低温で培養する方がRecombnationが起きにくいので結果インサートがあるプラスミドを得やすい等の情報があれば教えてください。

(無題) 削除/引用 No.370-2 - 2012/04/05 (木) 17:39:44 - ~ >この配列をクローニングしたいのですが、何かいい方法はないでしょうか？ BACライブラリーにあれば 　切り出し→BAC骨格ベクターでサブクローニング が出来るかもしれません。

タンデムリピート配列のクローニング 削除/引用 No.370-1 - 2012/04/05 (木) 17:29:41 - T.K ある遺伝子のプロモータ領域を調べていてPCRによって増幅はできるものの、クローニングができません。長さは3k程度。ベクターはpBlueです。 その配列の上流1.5kはNCBI等のデータベースでもNとなっている領域でNの領域の下流にプライマーを設計しdirect sequenceで下流側から調べたらCA richな配列であることが分かり400bp以上続いてることが分かっています。また、上流からのdirect sequenceはGTが30程度続いたところで、止まってしまっていて、おそらくPCR産物にマイクロサテライトの繰り返し回数に差がある為だと思われます。下流の配列から新たにウォーキングするためのプライマーも設計は困難で、試しましたが上流からと同じような状態になりました。 現状このような状態でおそらく1k以上GTが主に続くような配列だと思われます。この配列をクローニングしたいのですが、何かいい方法はないでしょうか？　またシークエンスだけでもできればいいと思っていますが、マイクロサテライトに差があるためそれも困難な状況です。何かいい手法を知っていらっしゃる方がいたらご教授ください。

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