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アドバイス有難うございます。 削除/引用 No.3712-8 - 2015/01/15 (木) 10:18:44 - Th17 proteinさん　HIHさん アドバイス有難うございます。 お返事遅くなりました。 結論的には、下記の条件で再実験することに決めました。 �@5日間の分化であればTCR再刺激処理をいれること。 �Aサイトカイン刺激因子を3日おきに交換し、培養日数を10~14日間まで延長すること �B複数の末梢血で試すこと �C必要であればIMDM培地を試すこと >[Re:7] proteinさんは書きました : > ２．TGFbの濃度が高過ぎると抑制的に働くという話があったような。 > ３．内在性のAHRリガンドが含まれたIMDMのほうが誘導しやすいという報告あり。 > ４．supernatantのIL-17の検出のためにはaCD3かPMA/IOによる再刺激が必要と思います。 2.TGF-b1 10ng/ml程度であれば抑制的には働かないようです 3.参考になります。J Exp Med 2009 vol 206 p43の論文読まさせていただきました。 4.5日間th17分化誘導し、anti-CD3/anti-CD28再刺激し培養上清中IL-17を測定した論文(nature immunology 2008 vol9　650)がありましたので、試したいと思います。 >[Re:6] HIHさんは書きました : > > �@フラットボトムのプレートに少し密度を低くして培養開始してみると分化した細胞がエンリッチされることはあります。 > > �A良く見てませんでしたがX-VIVOメディウムでは血清を用いたRPMI培地での培養に比べて顕著にTh17分化が起こりにくいという報告があった気がします。 > > �B個人差についても一度検討した方が良いかと 1.96well U-bottomのまえに48well flat plateを使いましたが駄目でした。 2.X-VIVOの前にRPMI1640つかったのですが、結果は同じでした。 In Vitro Cell Dev Biol Anim. 2011 Sep;47(8):581-92　を参考にしてX-VIVO15使用に切り替えました。 3．複数人の末梢血で試したいと思います。

(無題) 削除/引用 No.3712-7 - 2015/01/09 (金) 06:04:52 - protein 数年前の知識からアップデートされていないのであまり参考にならないとは思いますが、、 １．そもそもnaive TからはTH17は誘導しにくいのではなかったでしょうか。 ２．TGFbの濃度が高過ぎると抑制的に働くという話があったような。 ３．内在性のAHRリガンドが含まれたIMDMのほうが誘導しやすいという報告あり。 ４．supernatantのIL-17の検出のためにはaCD3かPMA/IOによる再刺激が必要と思います。

(無題) 削除/引用 No.3712-6 - 2015/01/08 (木) 14:57:46 - HIH 3日目の様子を見る限り細胞に刺激は入っていると思います。 CD28に関してもTh17にネガティブに働くことは基本的にないです。 特定のコンディションに置かれた場合は少し違いますが… そしてナイーブな集団の回収に問題ないのであればあとは… �@フラットボトムのプレートに少し密度を低くして培養開始してみると分化した細胞がエンリッチされることはあります。 �A良く見てませんでしたがX-VIVOメディウムでは血清を用いたRPMI培地での培養に比べて顕著にTh17分化が起こりにくいという報告があった気がします。 �B個人差についても一度検討した方が良いかと

アドバイス有難うございます 削除/引用 No.3712-5 - 2015/01/08 (木) 14:50:31 - Th17 vestさん アドバイス有難うございます。 5日目の細胞は、遺伝子発現の解析用に回収したため、 flowcytometryでの解析は実施できませんでした。 ご指摘の様に、IL-17産生が認められないので、 5日目では分化していないと考えられます。 回収した細胞の転写因子(RORrc,T-bet,GATA3)の発現を調べてみたいと思います。 先程、webで検索したらth17分化誘導キットが市販されていましたので ポジコン？として購入しようかと思っております。

(無題) 削除/引用 No.3712-4 - 2015/01/08 (木) 14:25:17 - vest 細胞集団はどうなってますか？ ５日目にTh17が検出できていないなら分化できていないのでは？ あと、CD28はIL-17産生を抑制するという報告がどこぞでありませんでした？ それでIL-17産生がなくなる理由にはなりませんので、余談ですが。

アドバイス有難うございます 削除/引用 No.3712-3 - 2015/01/08 (木) 14:07:01 - Th17 HIHさん アドバイス有難うございます。 セルソーターがありませんので、Macsでの分離しかできないのですが 分離した細胞をflowcytometryにて解析した結果、 95%はCD4陽性CD45RA陽性細胞でしたので、 純度には問題ないかと考えます。 私の末梢血でしか行ていないので、何とも言えませんが個人差でしょうか…。

(無題) 削除/引用 No.3712-2 - 2015/01/08 (木) 13:57:21 - HIH 細かい刺激条件についてはFlat Bottomにするとか細胞数を考えるとか色々あるとして… とりあえずCD4isolation kitではナイーブThではなくWholeTh細胞が取れているのでは？ ヒトPBMC中ではCD45RA+CD25-フラクションは半分もいないと思います。 きれいなナイーブ集団からでないと分化効率は著しく下がるかと。 もう一点、ヒトCD4陽性細胞からのTh17細胞誘導効率は実はものすごく個人差が出ます。 効率よく分化できるドナーを探す必要があるかもしれません。

ヒトTh17細胞分化誘導 削除/引用 No.3712-1 - 2015/01/08 (木) 13:41:01 - Th17 ヒトナイーブCD4T細胞からIL-17産生細胞（Th17細胞）誘導を試みているのですが、作製出来ず困っております。 下記に示した方法を用いたのですが、論文の作製方法を見ていると10〜14日まで培養する方法や、5日以降2~3日おきに分化誘導因子を交換する方法、anti-IFN-g +anti-IL-4抗体を添加する方法、10日目にanti-CD3/anti-CD28抗体で24h刺激し培養上清を回収する方法など多くの方法があり、どこを改良すべきか困惑しております。 作製のご経験者がいらっしゃいましたら、アドバイス宜しくお願いします。 方法 96U-bottom 7C 2時間にて抗CD3抗体(10ug/ml:BD,UCTH1 clone)固相化 ↓ ヒト末梢血由来ナイーブCD4T細胞　(CD4isolation kit+MSカラムを用いて単離）1x10^5cells/wellで播種 ↓ 刺激または分化誘導因子添加 soluble anti-CD28 5ug/ml(BD CD28.2) IL-6 5ng/ml（peprotech) IL-1b 10ng/ml （peprotech) TGF-b1 10ng/ml （peprotech) IL-23 100ng/ml （peprotech) X-VIVO15培地で培養液量200ulにする。 3日目培地黄色、コロニーの形成が認められる。 5日間培養後、回収した上清IL-17ELISAおこなったが検出できず(16pg/ml以下）。

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