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(無題) 削除/引用 No.3718-12 - 2015/02/06 (金) 02:02:09 - おお >[Re:11] cycさんは書きました : > >[Re:9] おおさんは書きました : > > > それならG1で止まっているという結論でいいのでは。一昔前からこの分野はフォローしてないので、G1 arrestで一般的にcyclin Dがどのような挙動を示すかわかりませんが(ご自身でお調べになるといいかと思います)、G1 arrestはcyclin Dの次のEで制御されているというのがメジャーな説だったように思います(そのあたりにAも関与して微妙なところはあるのですが)。 > > G1 arrestに関する文献を探していたら、cyclinE-cdk2複合体を阻害するp27の発現が上昇したり、cyclinE、cdk2がユビキチン-プロテアソーム系で分解したりすることでG1 arrestが起きるという報告がありました。 > しかし、私の実験結果の場合、G1 arrestが起きていると予想されるサンプルで、cyclinDが増加してcyclinEが低下していたので、cyclinEによる制御ではないと考えました。 しばらくこの質問をフォローしてませんでしたが、、、 cyclin Dのところで止まっているのだから、Eを活性化しないという制御がされているということかと思いますが、、、それがあなたの実験において、p21/27/57などのinhibitorなのか、蛋白分解なのか、transcription抑制なのか、、、p16などがあがっていればDの活性のブロックなのでちょっと面白いかもしれません。 そのあたりobservationをしっかりしてあとはいままで発表されているデーターを交えたdiscussionを加えればいいことだと思います。

(無題) 削除/引用 No.3718-11 - 2015/02/03 (火) 15:48:25 - cyc >[Re:9] おおさんは書きました : > それならG1で止まっているという結論でいいのでは。一昔前からこの分野はフォローしてないので、G1 arrestで一般的にcyclin Dがどのような挙動を示すかわかりませんが(ご自身でお調べになるといいかと思います)、G1 arrestはcyclin Dの次のEで制御されているというのがメジャーな説だったように思います(そのあたりにAも関与して微妙なところはあるのですが)。 G1 arrestに関する文献を探していたら、cyclinE-cdk2複合体を阻害するp27の発現が上昇したり、cyclinE、cdk2がユビキチン-プロテアソーム系で分解したりすることでG1 arrestが起きるという報告がありました。 しかし、私の実験結果の場合、G1 arrestが起きていると予想されるサンプルで、cyclinDが増加してcyclinEが低下していたので、cyclinEによる制御ではないと考えました。 ただし、p27によるcyclinEの阻害やユビキチンによるcyclinEの分解によって、cyclinEの発現が低下して、なおかつcyclinDの分解がまだ起きていない段階ならば、実験結果と一致すると思います。 そのようなことはあるのでしょうか？ G1 arrestがcyclinDで制御されている文献をなかなか見つけることができないので・・・。 （p21の誘導によるcdk4の阻害によってG1 arrestが起こるという論文は発見できました）

(無題) 削除/引用 No.3718-10 - 2015/01/13 (火) 14:41:28 - cyc >[Re:9] おおさんは書きました : > まあそういうことですね。G1期の細胞だけわけてcyclin Dをみたばあい、G1期に何ら変化をきたしてないなら、cyclin Dのレベルは刺激してない場合と一緒だろうし、逆にG1期で刺激が何か積極的にcyclin Dの発現を促しているなら、G1期の細胞で比較しても差があるだろうし、さてどっちなんだろうということです。 > 理解できました。丁寧な説明ありがとうございます。 今の結果だけでは何とも言えませんね。 追実験を検討してみます。

(無題) 削除/引用 No.3718-9 - 2015/01/13 (火) 11:57:26 - おお >[Re:8] cycさんは書きました : > ご意見ありがとうございます。 > > おおさんのおしゃる通り、G2/Mへの影響はほとんどなく、S期が著しく低下していました。 > 細胞の増殖はほとんどなく、むしろ刺激によりダメージを受けているので、この結果に納得できました。 > 具体的にどの段階で周期が止まっているのかは、詳しいcdkなどの解析が必要ということでしょうか？ > それならG1で止まっているという結論でいいのでは。一昔前からこの分野はフォローしてないので、G1 arrestで一般的にcyclin Dがどのような挙動を示すかわかりませんが(ご自身でお調べになるといいかと思います)、G1 arrestはcyclin Dの次のEで制御されているというのがメジャーな説だったように思います(そのあたりにAも関与して微妙なところはあるのですが)。 なので蛋白はある程度見た方がいいでしょうけど、そのG1 arrestの説明的なデーターになるかもしれません。 > > >[Re:4] おおさんは書きました : > > G1のポピュレーションが増えたから、cyclin D1が増えたように見えるだけで、刺激後も刺激前もG1のポピュレーションだけピックアップしたら同じレベルかもしれません。 > というのは、どういった意味でしょうか？ > G1の細胞割合が増えたから、G1期に発現するcyclinDの発現も上がったようにみえている。 まあそういうことですね。G1期の細胞だけわけてcyclin Dをみたばあい、G1期に何ら変化をきたしてないなら、cyclin Dのレベルは刺激してない場合と一緒だろうし、逆にG1期で刺激が何か積極的にcyclin Dの発現を促しているなら、G1期の細胞で比較しても差があるだろうし、さてどっちなんだろうということです。

(無題) 削除/引用 No.3718-8 - 2015/01/13 (火) 09:36:14 - cyc ご意見ありがとうございます。 おおさんのおしゃる通り、G2/Mへの影響はほとんどなく、S期が著しく低下していました。 細胞の増殖はほとんどなく、むしろ刺激によりダメージを受けているので、この結果に納得できました。 具体的にどの段階で周期が止まっているのかは、詳しいcdkなどの解析が必要ということでしょうか？ >[Re:4] おおさんは書きました : > G1のポピュレーションが増えたから、cyclin D1が増えたように見えるだけで、刺激後も刺激前もG1のポピュレーションだけピックアップしたら同じレベルかもしれません。 というのは、どういった意味でしょうか？ G1の細胞割合が増えたから、G1期に発現するcyclinDの発現も上がったようにみえている。(cyclinD/細胞数は刺激前も刺激後も変わらない)という意味でしょうか？ 初心者でお恥ずかしいです。

(無題) 削除/引用 No.3718-7 - 2015/01/13 (火) 08:42:07 - おお あとcyclin Dで活性と書きましたが、それに結合しているcdk4 and/or 6の活性でした。こちらはリン酸かがバンドシフトで見れて活性が推察できます。

(無題) 削除/引用 No.3718-6 - 2015/01/13 (火) 08:38:27 - おお G1で止まっているなら、S期の細胞が減っているでしょうけど、G2/Mは比較的影響が少ないでしょう。G2/Mが比較的スムーズに流れるようになったならG2/Mが先にへって、S期の影響は比較的少い、場合によっては増えているかもしれません。 結局細胞が結果無刺激より増えたのか、減ったのかで上記のどちらがもっともらしいか推測できるのではとおもいます。24時間まで何も起こらず36時間でその様な結果になったなら、細胞の密度などのconditionもあるかもしれません。無刺激で36時間のcell cycle populationとの比較があった方がいいかもしれませんが、増殖速度がかわると密度をそろえられないので、比較は慎重にしないといけないかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.3718-5 - 2015/01/12 (月) 14:06:06 - toto みなさんご意見ありがとうございます。 補足なのですが。 刺激を加えて12時間ごとにフローサイトメトリーで細胞周期の測定を行った所、36時間後にG1期の細胞割合が増加していました。 cyclinD1の発現は同じ36時間後の遺伝子をPCR、蛋白質をウェスタンブロットで検出しました。(結果は両方同じで、刺激後でcyclinD1の発現が増えました) この結果だけで何が言えるのかを考えたのが、質問の文章になっています。

(無題) 削除/引用 No.3718-4 - 2015/01/10 (土) 08:48:44 - おお >細胞周期G1期の細胞割合が増加することが判明しました。 培養しているG1などのポピュレーションはバランスなので、G2Mの移行が早くなればG1は増えるし、実際にcell cycleがG1で止まっているかなど慎重に見ていくべきかと思います。cyclin D1の上昇はお示しの状況だけで推測すると、G1のポピュレーションが増えたから、cyclin D1が増えたように見えるだけで、刺激後も刺激前もG1のポピュレーションだけピックアップしたら同じレベルかもしれません。 cyclin inhibitorも一度チェックしておくといいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3718-3 - 2015/01/10 (土) 08:32:48 - qw ＞各cyclinの発現を解析したところ、 どんな方法で解析したかで、結果が変わります。 ＞cyclinD1の発現が刺激後に増加 発現が増加とは転写速度が増えたということを考えればよいのか？それともタンパク量が増えたという意味なのか？ 刺激後とは、どの程度の時間経過なのか？ ＞時期の間で細胞周期が停止しているために、cyclinD1蛋白質がどんどん蓄積していると考えてよいのでしょうか？ タイムコースを追ってみれば良いのではないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3718-2 - 2015/01/10 (土) 01:06:49 - おお 蛋白が増えていても、活性がなければ機能してないですし、cyclin Dはある細胞では細胞分かに寄与しているという報告もあります。 活性はおおざっぱにリン酸化で推察できますSDSPAGEで分離できるはずです。

cyclinD1の役割 削除/引用 No.3718-1 - 2015/01/09 (金) 19:00:18 - cyc ある細胞で、刺激を加えると細胞周期G1期の細胞割合が増加することが判明しました。 そこで各cyclinの発現を解析したところ、cyclinD1の発現が刺激後に増加することが分かりました。 cyclinD1はG1期の進行に関わる因子でありますが、実際cyclinD1だけではなく、S期への進行のためにはRb蛋白質が遊離し、cyclinEに伝わっていく必要があることは知っています。 しかし、cyclinD1が増加して、cyclinEやAが減少したということは、cyclinDが必要な時期からcyclinEが必要になる時期の間で細胞周期が停止しているために、cyclinD1蛋白質がどんどん蓄積していると考えてよいのでしょうか？ 細胞周期関連に関しては全くの素人なので、参考意見をよろしくお願いします。

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