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(無題) 削除/引用 No.3732-6 - 2015/01/13 (火) 18:08:51 - TS 転写は、WET（タンク式）なのですね。 そうだとすると、30kDaは容易に転写されると思うので、 基本的に何かが十分ではないのでしょうね。 電圧、時間が提示されていないので、そのあたりを明記した方が良いかと。 それと、ゲルにタンパク質が残っていたのは、30ｋDa付近なのですか？ 他の方がご指摘のように、ゲルに残っているのであれば、メンブレンの吸着キャパの問題ではないでしょうが、PVDFであれば60マイクログラムは、ちゃんと分離できている領域は、大丈夫と思う。 ニトロセルロースだとどうかなぁ。

(無題) 削除/引用 No.3732-5 - 2015/01/13 (火) 14:12:21 - おお 話がかみ合ってないような、、、 たとえば10ug-30ugのtotal lysate (細胞を溶解したようなサンプル)をminigelで流した場合、一度optimizeしてしまえばいじる必要は特殊な場合をのぞいてまずないです。 もし何か精製された蛋白60ugのっけているなら、そんなに必要か、それが幕の上に乗っかってキャパシティーを超えないかちょっと考えてみてください(わたしは調べないとすぐわかりませんので)。そもそもミニゲルなら多すぎて非常に厳しい量のように思います。 それを考慮した上で、ゲルに残っている量がどれだけあなたの実験にsignificantなのかは一度考えて見るべきかと思います。transfer bufferにメタノールを入れるのがたいていのほうほうで一つのバンドが60ugもあるとするならばゲルないで凝縮する可能性もありますし、数ugのれば実験として十分であるならば60ugをちゃんとtransferする条件検討に意味があるのか。ゲルから出やすいconditionはありますが、それは同時に膜への吸着を弱めることがたいていで、ゲルに残った1ugをゲルから溶出するために、膜の結合が弱まって55ugしか膜についてませんとかいう話にもならなくないので、状況の見極めが必要でしょう。 いろいろ改善方法はありますが、ゲルが厚い(1.5mmとか)ならwetでO/N transferが一番改善すると思います。ゲルが薄いならコームしだいではover loadなので、載せる量を一度考え直してください。薄くてもO/Nはたいていうまくいきます。そのほか1-1.5時間のtransferならmethanolの量をへらすとかSDSを0.001%ぐらい入れるなどがよくやられると思います。

(無題) 削除/引用 No.3732-4 - 2015/01/13 (火) 10:51:45 - gyan マーカーのほうは全て転写されていたので、転写の条件は大丈夫かなと思ったのですが、タンパク質によって転写Bufferとか変えなきゃだめなんでしょうか？ ゲルには結構濃くバンドが残っていました。　 ちょっとグラムではわかりませんが、目ではっきり見えるぐらいです。

(無題) 削除/引用 No.3732-3 - 2015/01/13 (火) 00:12:58 - おお >[Re:1] gyanさんは書きました : > あけましておめでとうございます。 > > SDS-PAGEしたあと、メンブレンに転写したのですが、ゲルにまだバンドが残ってました。 > > タンパクの量は約60μgです。 > > 約30kDaで、転写BufferはSDS無しです。 > > メンブレンに転写できるタンパク質量って限度があるのでしょうか？ なにかのlysateならば条件の改善が必要かと思います。その蛋白単独で60ugであればオーバーロード気味ではないかと、、、ただ膜につくかどうかはおいておいて蛋白はゲルからでてはいきますが、、、 60ugの30kDaの蛋白のうち0.5ugぐらいがゲルで検出されている可能性はありませんか?

(無題) 削除/引用 No.3732-2 - 2015/01/12 (月) 22:45:26 - yyy ゲルの中に残ってるということは、メンブレンと接触もしてないので、メンブレンの吸着の限界とは別の問題だと思います。 30ｋDaでゲルに残ってるということは、転写の条件を検討した方が良いかと。

メンブレンに転写について 削除/引用 No.3732-1 - 2015/01/12 (月) 18:10:03 - gyan あけましておめでとうございます。 SDS-PAGEしたあと、メンブレンに転写したのですが、ゲルにまだバンドが残ってました。 タンパクの量は約60μgです。 約30kDaで、転写BufferはSDS無しです。 メンブレンに転写できるタンパク質量って限度があるのでしょうか？

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