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名無し様、ご返信ありがとうございます。 削除/引用 No.3753-12 - 2015/01/26 (月) 10:49:41 - chima ＞経験では、（レクチン全般について言えるかもしれないですが）保存中に失活というか変性しやすい気がしています。購入当初はちゃんと特異的な反応が見られますが、時間経つとどうも非特異的な反応（何でも反応してしまう感じ、バックがだんだん高くなる感じ）が見られるようになりました。（レクチンは凍結に弱いらしく、凍結不可と書いてある事が多いので４Cで保存でした）こうなると、何をみているのかが分からなくなり、結果を考察する意味が無くなるので、短期間でまとめて実験してしまうような計画を立てて、レクチンを入手したら早めに使う方がいいと思います。 本実験で用いているレクチンは、4℃で保存して1年ほど経っておりますので、名無し様のような状況が起こっている可能性は大いにあります。 FITC-lectinを購入し直して、再実験をしてみます。 どうもありがとうございます。

おお様、ご返信ありがとうございます。 削除/引用 No.3753-11 - 2015/01/26 (月) 10:45:03 - chima ＞親和性の問題じゃないでしょうか。 FITC-lectinとanti-FITC antibodyのどちらがひっかけているかすこし慎重に判断した方がいいでしょうけど。 FITCを直接スキャンするシステムが使えますでしょうか? あるいは大腸菌で検出できない量をきめて、その量の糖修飾のついた蛋白を流すようにして修飾の解析をするか。 リコンビナントやレクチンが量的に多すぎて（感度が良すぎて）E.coliリコンビナントでも見えてしまっている可能性が高いので、まずは量を検討したいと思います。 それでもだめなら、FITCの蛍光検出機器はありますので、anti-FITC antibodyがひっかけている可能性も検討したいと思います。 ＞分子量が減っているとおっしゃっているので糖修飾が外れていることは確かなので、糖修飾が存在するという証明はできてますよね。 分かりにくい記述で申し訳ないのですが、目的タンパク質A(21 kDa)は消化でバンド位置は変わらず、他のタンパク質B（66 kDa）では同様の操作でバンドシフトがあります。

(無題) 削除/引用 No.3753-8 - 2015/01/25 (日) 21:11:53 - 名無し 経験では、（レクチン全般について言えるかもしれないですが）保存中に失活というか変性しやすい気がしています。購入当初はちゃんと特異的な反応が見られますが、時間経つとどうも非特異的な反応（何でも反応してしまう感じ、バックがだんだん高くなる感じ）が見られるようになりました。（レクチンは凍結に弱いらしく、凍結不可と書いてある事が多いので４Cで保存でした）こうなると、何をみているのかが分からなくなり、結果を考察する意味が無くなるので、短期間でまとめて実験してしまうような計画を立てて、レクチンを入手したら早めに使う方がいいと思います。

(無題) 削除/引用 No.3753-7 - 2015/01/22 (木) 23:18:23 - おお >[Re:6] chimaさんは書きました : > > E.coliリコンビナントでもレクチンで認識されてしまう点については、どのように考えたら良いでしょうか…。 これはやはり非特異か特異的かはおいといて、親和性の問題じゃないでしょうか。 FITC-lectinとanti-FITC antibodyのどちらがひっかけているかすこし慎重に判断した方がいいでしょうけど。 FITCを直接スキャンするシステムが使えますでしょうか? あるいは大腸菌で検出できない量をきめて、その量の糖修飾のついた蛋白を流すようにして修飾の解析をするか。 分子量が減っているとおっしゃっているので糖修飾が外れていることは確かなので、糖修飾が存在するという証明はできてますよね。

flow joe様、ご返信ありがとうございます。 削除/引用 No.3753-6 - 2015/01/22 (木) 22:40:36 - chima ＞O-グリコシダーゼは完璧じゃないよ。特異性を調べてみると良いです。 基質特異性はGalβ→3GalNacα1↓-（Thr）ということでよろしいでしょうか？ 当該レクチンの認識糖鎖情報から予想している糖鎖構造がcore 1なので、O-グリコシダーゼで切除されると思うのですが、情報が足りないのでしょうか…。 論文やデータベースをもう少し調べてみます。 E.coliリコンビナントでもレクチンで認識されてしまう点については、どのように考えたら良いでしょうか…。

(無題) 削除/引用 No.3753-5 - 2015/01/22 (木) 18:06:30 - flow joe O-グリコシダーゼは完璧じゃないよ。特異性を調べてみると良いです。

おお様、ご返信ありがとうございます。 削除/引用 No.3753-4 - 2015/01/21 (水) 17:55:52 - chima 投稿に気づかず返信が遅くなりました。 ＞N-glycosylationは否定できるんでしょうか。 N-glycosylationもあるかもしれません。 実験の目的としては、あるレクチン（O-glycan認識）で認識された、2D-PAGE上のスポットのタンパク質を同定したので、そのタンパク質に本当にO-glycanが付加しているかを知りたいのです。 また、同定に用いたのはマウス試料で、リコンビナントはヒトの配列（推定O-glycosylation sitesは保存）なので、種間で保存されているかどうかも確認したい点です。 グリコシダーゼ消化した後のリコンビナントタンパク質の検出に用いているレクチンも同定に用いたレクチンです。 ＞あとあり得るなら、精製度の問題でバックグランドを拾っているとか。また感度がよすぎて、見たいシグナルが飽和して弱いシグナルと同程度に見えるとか。 リコンビナントはFLAG tagでアフィニティ精製した市販品を購入しています。 メンブレンのtotal protein staining、レクチンブロット、ウェスタンブロットで比較してみると、レクチンブロットのシグナルは目的タンパク質のところにのみ明瞭に出ていますので、どうもバックグラウンドではないようです。 感度が良すぎてシグナルに差が見られない可能性はありますので、レクチン濃度を検討してみたいと思います。 ちなみに、E.coliで発現させたリコンビナント（糖鎖付加しないはずですよね？）でもシグナルが出てしまうので、タンパク質自身が当該レクチンと親和性があるのかも？とも考えております。 ＞酵素処理後lectin resinでpull downして 結合しないか見る手もあるかもしれません。 試してみたいと思います。 できればマウス試料でも糖鎖付加を確認したいのですが、その場合はIP→レクチンブロット、ウエスタンブロットが良いですよね？ ＞その蛋白は糖鎖修飾なしでどれくらいのサイズで、それらの酵素処理したとき、どれくらいのサイズにバンドが出ますか? 約25 kDaです。酵素消化しても未消化の場合と同じ位置にバンドが検出されます。 何かお気づきの点がありましたらご指摘願います。 どうぞよろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.3753-3 - 2015/01/17 (土) 08:15:25 - おお その蛋白は糖鎖修飾なしでどれくらいのサイズで、それらの酵素処理したとき、どれくらいのサイズにバンドが出ますか?

(無題) 削除/引用 No.3753-2 - 2015/01/17 (土) 02:23:32 - おお N-glycosylationは否定できるんでしょうか。 あとあり得るなら、精製度の問題でバックグランドを拾っているとか。 また感度がよすぎて、見たいシグナルが飽和して弱いシグナルと同程度に見えるとか。 酵素処理後letin resinでpull downして 結合しないか見る手もあるかもしれません。

グリコシダーゼ消化してもレクチンで認識される 削除/引用 No.3753-1 - 2015/01/17 (土) 01:31:48 - chima 現在、あるタンパク質について、糖鎖が付加していることを確認するため、グリコシダーゼ消化後、レクチンブロット（FITC-lectin / anti-FITC antibody）をすることにより確認しようとしております。 リコンビナントタンパク質（糖鎖が付加する宿主で発現）を下記条件で消化しました。 (1)未消化（bufferのみ） (2)シアリダーゼ、 (3)シアリダーゼ＋O-グリコシダーゼ SDS-PAGEゲル上でバンド位置を比較すると、グリコシダーゼ消化により多少低分子側にシフトするので、糖鎖が付加していると推測されました。 ですが、レクチンブロットでは、どのバンドも同等に検出されてしまいました。 酵素量を増やしたり、反応時間を長く（1h→4h→12h）しても結果は変わりませんでした。 別のタンパク質に対し同様の処理をした場合、グリコシダーゼ消化によりレクチンブロットでのシグナルが消失していたので、操作や酵素に問題はないと思われます。 上記の場合、どのような原因が考えられますでしょうか？ また、他に良い糖鎖付加の確認方法はありますでしょうか？ 思い当たることがありましたら、是非ご教示いただきたいです。 どうぞよろしくお願いいたします。

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