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(無題) 削除/引用 No.3774-25 - 2015/01/25 (日) 19:53:02 - mon >[Re:23] totoさんは書きました : > 低温培養、と書かれておられるのは井上法よりも温度を下げるということでしょうか？ いえ、20℃~25℃です。また、Electroporation用のコンピです。 きっちりと測定したことはないですが、DH10Bの1/10-1/50くらいの効率ですね。

(無題) 削除/引用 No.3774-24 - 2015/01/25 (日) 18:26:59 - ~ 私が心配しているのは、今からトランスフォーメーションするコンピを変えるかどうかではなく、 今の時点でプラスミドがダメになっていて、今さらそれをどうこうしても無駄で、 貰い直す必要があるのではないかということです。 >オリジナルの調製はDH5alphaにより調製 これは誰が操作して、普段は誰が操作していたのでしょうか？ ウイルスベクターだと、培養温度を30度などに落として組換えを減らしたり、 培養時間を短めにする方法がありますが、 前のラボの標準的な調整方法で取られていますか？

(無題) 削除/引用 No.3774-23 - 2015/01/25 (日) 11:57:41 - toto monさん、横からすみません、教えて下さい。stabl3,4とうちでも作ってますが、XL1などに比べて効率が2桁ほど悪いcompiしか取れてません。SURE2はXL1よりやや落ちる程度のCompiが取れるのですが。低温培養、と書かれておられるのは井上法よりも温度を下げるということでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3774-22 - 2015/01/25 (日) 10:55:01 - 初学者 mon様ありがとうございます！ Stbl3が自作できると知って、とても嬉しいです。 DH5alphaは井上法で作製していますが、同様の方法で大丈夫ですよね。 作製してみます。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.3774-21 - 2015/01/25 (日) 10:39:46 - mon stbl3のコンピ「も」自作しています。 特別な培地を使う株でない限りコンピを作製できない大腸菌はないと思いますよ。

(無題) 削除/引用 No.3774-20 - 2015/01/25 (日) 10:37:23 - mon stbl3のコンピは自作しています。 DH10BやXl1Blueよりは導入効率が悪いので、低温培養して作製しています。

(無題) 削除/引用 No.3774-19 - 2015/01/25 (日) 10:17:28 - 初学者 おお様、mon様 経験に基づいたコメントをありがとうございます。 自作のDH5alpha以外に、JM109がありましたので、それで今行っています。 Stbl3を買わねばならないのかなと思っていましたので、もう少し今あるマテリアルで検討出来そうで良かったです。ありがとうございます。 mon様 今後、レンチも使って行く予定です。Stbl3を使われているんですね。 話が脱線して恐縮ですが、自作でStbl3コンピは作製できますでしょうか？ DH10Bはラボにないので、なんとかレトロ用プラスミドがJM109で上手に形質転換できるといいのですが・・ ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.3774-18 - 2015/01/25 (日) 07:53:43 - mon 同じベクターでも、あるインサート(cDNA)の場合だけ、汎用しているDH10Bではダメ(deletionする）で、XL1BlueならOKなときもありました。XL1Blueは増殖が遅いので、それが良いのかな？ レンチウィルスベクターは安定性が良い（といわれる）Stbl3を多用していますが、まれにコンピが足りない場合DH10Bで試すこともあります。問題無いことも多いです。 おおさんも提案していますが、他の株を使ってみるだけでアッサリ解決するかもしれません。 既におかしくなったplasmidが混入している可能性もありますから、複数のクローンのcheckは必要ですね。

(無題) 削除/引用 No.3774-17 - 2015/01/24 (土) 15:05:53 - おお >[Re:16] 初学者さんは書きました : > > おお様がレトロやレンチのベクターを形質転換する際にはDH5alphaやTOP10などを構わず使われていますか？それともLTRなどリピート配列を持つものはなるべく特別な大腸菌（Stbl3など）を用いていますでしょうか？ たまにそう言うプラスミドを扱いますが、リピートしている配列を考慮したような大腸菌はつかってませんね。。。 > > > こんなことは初めてで、３つの異なるレトロウイルスプラスミド全てがおかしくなっていました。 > 海外では普通にprepできていたんですが・・X-rayの可能性もあるのでしょうか・・ > 飛行場のセキュリティーのx-rayでおかしくなるというはなしはあまりきかないですけどね。。。当たるより当たらない方がいいとかそう言う話をするのをきいたことはありますが。 大腸菌はほかに株はないですか?とくにリピートした配列用に特化されてないやつでもいいから。ちょっとした菌の性質の違いや相性みたいなもので、違ってくるかもしれないので。

(無題) 削除/引用 No.3774-16 - 2015/01/24 (土) 14:18:06 - 初学者 おお様 コメント、引き続きいただきましてありがとうございます。 コンピテントセルは自作のDH5alphaです。 海外のlabでは確かにDH5alphaで行っていたと思うのですが、私自身が形質転換したものではないので確実な情報ではないです。 おお様がレトロやレンチのベクターを形質転換する際にはDH5alphaやTOP10などを構わず使われていますか？それともLTRなどリピート配列を持つものはなるべく特別な大腸菌（Stbl3など）を用いていますでしょうか？ 今私が使っているDH5alphaではpcDNA3.1+ベースのプラスミドは普通に取れ、全く問題は無さそうです。オリジナルのプラスミドを同様に酵素で切断すると正しいサイズのものが確認されるので、おそらく形質転換によっておかしなプラスミドが取れてしまっているのだと思っていますが・・。 こんなことは初めてで、３つの異なるレトロウイルスプラスミド全てがおかしくなっていました。 海外では普通にprepできていたんですが・・X-rayの可能性もあるのでしょうか・・

(無題) 削除/引用 No.3774-15 - 2015/01/24 (土) 14:06:15 - おお ん、やっぱコンピ自身が変になってるんじゃないか。。。プラスみどなしでコロニー出るとか、、、まあそれがなくとも性質が変わってしまってるかもしれない。 あとはファージのコンタミとか、、、

(無題) 削除/引用 No.3774-14 - 2015/01/24 (土) 08:55:30 - 初学者 おお様 昨日アドバイスをいただいたように、30℃, 25 ug/ml Ampicillin, エアレーションを良くして行ってみました。当然大腸菌のgrowthは大変遅かったですが、なんとかprepできました。 その結果はやはり、壊れていそうでした。 EcoR1単独でcutしたもの、していないものとで比較しました。EcoR1が活性有りだと知るためにpcDNA3.1+を同様にcutしまして、こちらではbandシフトが認められました。 DH5alphaでこれらレトロウイルスベクターを形質転換していましたが、LTRなどrepeat配列のあるプラスミドの場合、やはりそれ用の大腸菌に変えるべきということでしょうか。 ~様 オリジナルの調製はDH5alphaにより調製したもので、Qiagenのmidiprep kitを用いて精製したものです。~様の言われるように大腸菌のホストを変えて、適切な条件で試すべきですよね。ただ、前のlabでは確かに市販のDH5alphaで調製していたんですが・・ちなみにこちらでは自作のDH5alphaで形質転換して失敗が続いています。

(無題) 削除/引用 No.3774-13 - 2015/01/23 (金) 18:49:30 - ~ レトロウイルスベクターは削れることがありますが、 調整時には何の大腸菌でどのようにして増やしたのでしょうか？ 手持ちの材料がまともかどうかを確認せずに作業するのは時間の無駄かもしれません。 エアーメールで手紙に染み込ませて送ってもらうとか…

(無題) 削除/引用 No.3774-12 - 2015/01/23 (金) 16:31:40 - 初学者 中年様 コメントありがとうございます。 はい、向こうではこちらで私が行ってる方法と同様の方法でprepできていました。 > これは、「形質転換体のシングルコロニーを培養して調製したプラスミド標品を泳動すると３本以上のbandが出る」ということでしょうか。 はい、その通りです。 10個コロニーをピックアップして、それぞれで制限酵素cut/uncutで流すと、10個のコロニーのuncutでもバラバラのbandの出方をします。壊れていそうとの印象を持っています。 > 中でも元々の標品では量としてはわずかであった短くなったプラスミドが優先して増えてしまっているということではないかと思います。 その可能性が高そうですね。ありがとうございます。 先ほどおお様からコメントいただいたエアレーションを良くして、30度で、抗生剤を下げる方法を今行っています。 向こうでは実は15 ml tubeに2 mlのLB＋アンピシリン100 ug/mlをfinalで加えしっかりフタをした後、37度で培養するようにと言われていました。この方法だとエアレーションは悪いですし、抗生剤は異常な高濃度ですし、37度なので過酷な状況だったのかもしれません。これで解決するといいのですが・・ 774様 言葉足らずでした。 0.5ulを1000倍希釈して、その1 ulを形質転換に用いました。 Addgeneなどを見るとレトロベウターはStbl3を使って形質転換しているものを多く見ます。 今再度試しているもので上手くいかなければStbl3を買って試してみます。 （Stbl3ってコンピテントセル作れますかね・・）

(無題) 削除/引用 No.3774-11 - 2015/01/23 (金) 16:22:24 - 初学者 いぬ様 聞かれたことに応えておりませんでした。 はい、LBの選択培地で、アンピシリンを加えています。大腸菌を撒かなかった、もしくは形質転換しなかった大腸菌を撒くというネガコンは取っていません。 おお様 コメントいただきありがとうございます。 全く別のpcDNA3.1+（インサート有り）を同時に同様の制限酵素で切断し、インサートが切り出されてくることは確認していますので、制限酵素は大丈夫だと思います。 今、おお様からコメントいただいた30度、エアレーションを良くし、Ampを25 ug/mlに下げて再挑戦しました。これでだめなら次回37度で改めて形質転換し直したものを試してみます。

(無題) 削除/引用 No.3774-10 - 2015/01/23 (金) 15:52:45 - 774 Transformするには濃度が濃すぎる気がします。 1ulを100~1000倍希釈して、行うべきでしたね。 失敗しても何回かトライできますし。 これまで問題がなかったとはいえ、レトロウイルスなので、 組換えが起こっててもおかしくありません。 組換えの起こりにくいコンピで試すのがいいのではないでしょうか？ どうしてもダメなら事情を話して、送ってもらうのもありかなと思います。

(無題) 削除/引用 No.3774-9 - 2015/01/23 (金) 15:44:47 - おお でつかった制限酵素はちゃんとワークしてるんでしょうか。酵素自体がよわっているとか、ミニプレップで得たDNAに何か混じっているために切れが悪くなっているとかだと切れ残りがでてバンドがマルチプルになることがあります。

(無題) 削除/引用 No.3774-8 - 2015/01/23 (金) 15:41:04 - 中年 向こうにいらっしゃった時には、同じ手順できちんとプラスミドが取れていたのでしょうか？ また、「OC, CCCなど明らかに３種類以上のbandが出ています」という表現は曖昧でどういう状況なのかよくわからないのですが、場合によっては重要な手がかりかもしれません。これは、「形質転換体のシングルコロニーを培養して調製したプラスミド標品を泳動すると３本以上のbandが出る」ということでしょうか。もしそうだとすると、あまりに濃い濃度のプラスミドで形質転換を行ったために、どの形質転換体も複数種類のプラスミドを保持していて、中でも元々の標品では量としてはわずかであった短くなったプラスミドが優先して増えてしまっているということではないかと思います。

(無題) 削除/引用 No.3774-7 - 2015/01/23 (金) 15:38:47 - おお あ、いちおうx-rayはあたってるけどね。だからどうだといわれると、あれだけど。

(無題) 削除/引用 No.3774-6 - 2015/01/23 (金) 15:30:25 - おお >[Re:1] 初学者さんは書きました : > 向こうでもDH5alphaで、レトロウイルスベクターだからといって大腸菌のホストを変えるなどはしていませんでした。 > まあしなくてもたいてい取れるという話はありますけど、あなたの通常のミニプレップなどがけっこう大腸菌に負担がかかるやりかたで、たいていのものではうまくいくけど不安定なものでは変になってワークしないってことはあることはありえます。ちょっと丁寧にやってください。エアレーションとか培養時間とか。 あとはtransformationのヒートショックは37度とか培養温度を30度とか、抗生物質の濃度を下げるとかちょっとしたノウハウもないことはない。

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