BioTechnicalフォーラム [インサートが小さい場合のサブクローニング]

インサートが小さい場合のサブクローニング

No.3786-TOPIC - 2015/01/27 (火) 22:05:07 - iwa

初めて投稿させていただきます。

サブクローニングの課題が与えられています。ベクターが13kb, インサートが1kbです。ネットや参考書を調べたところ、インサートが大きい場合やベクターとインサートのサイズが同じくらいの場合の混合比率については色々な記載がありましたが、インサートが小さい場合の混合比率についての記載が見当たりません。

インサートの方を多くすべきとは思うのですが、ベクターを1とすると、モル比でインサートをいくつにするのが妥当でしょうか。今週は直接話せる相談相手がいないため、どなたかアドバイスを頂ければ幸いです。
　

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No.3786-8 - 2015/01/28 (水) 16:03:38 - AP

>インサートの方を多くすべきとは思うのですが、

なぜそう思う？

単一のインサートをクローニングするような実験ならモル比で1:1くらいでやっとけば大丈夫です。モル比を変えることで効率が変わったとしても、常識の範囲であれば、ある比率では0だったものが取れるようになるということはないし、取れていたものが0になってしまうということもないです。モル比をかえて取れ高を追求したところで、最終的に使うのは一クローンかせいぜい数クローンでしょう。

で、以上はそういう実験をルーチンにしている人のプラクティカルな考えかた。

>学部の研究室配属での課題で、あくまで練習？実習？だと思います。
というように、始めてやる人は、教科書通りに、ベクターインサート比率をふったライゲーションをやりーの、各ライゲーション産と適当な陽性・陰性対照物についてプレーティング量を振ってコロニーを数えーの、、、、、
ということをやって、どういうパラメータがどういう影響を与えるかというのを実地で体験するべきだと思う。アンチョコ本（昭和の死後か）やネットの情報なんて、小手先の手順のことばかりだし、嘘や迷信も多い。そんなんで頭でっかちになっても使えねーよ。最近では指導者もめんどくさがって、とりあえず実戦ができるだけのことしか教えない風潮があるけれど、初学者のそういう実験に関わるのを無駄だと思わずにしっかりやるべきだと思う。

(無題)

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No.3786-7 - 2015/01/28 (水) 11:15:54 - mon

サブクローニングは実験の主目的ではないので、出来るだけ省力化・短時間で済ませるのが理想です。人件費（時間）が一番貴重（高価）になりますよ。
ベクターだけのセルフライゲーション液も同時に行い、インサートの有無でコロニー数の差があるか比較すると、目的のクローンが容易に得られるか否か判断出来ます。

なお、大きなplasmidベクターへのサブクローニングで、ベクターの脱リン酸化処理（+ゲルからの切り出し精製）してもベクターだけのライゲーションでコロニー（大抵はオリジナルと同一）が得られる場合、制限酵素処理前にATP-dependent DNase(商品名PlasmidSafe）処理（+熱失活）して切断耐性（一本鎖？）のplasmidを分解しておくのが非常に有効です。

(無題)

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No.3786-6 - 2015/01/28 (水) 00:52:03 - おお

Why can you do it at once?

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No.3786-5 - 2015/01/27 (火) 23:51:46 - iwa

ご回答ありがとうございます。学部の研究室配属での課題で、あくまで練習？実習？だと思います。

アドバイスに従って、まずは1でやって、それでだめなら3や10に振ってみます。

(無題)

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No.3786-4 - 2015/01/27 (火) 23:40:23 - おお

その、かいだいとやらはれぽーとですか?それともじっさいのconstructionですか?