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(無題) 削除/引用 No.3793-13 - 2015/01/30 (金) 10:27:01 - MM mon様 確かに、無理に亜鉛bindingを飽和させなくてもいいかもしれません。おそらく50uMまで下げると凝集は防げるかと思いますので、それで結晶化までいくか試してみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.3793-12 - 2015/01/30 (金) 09:49:29 - mon 思いつきですが、タンパク外（Free)のZnを極力減らすため、 Znとの結合が安定であるならば、低タンパク濃度の時にZn添加＞Zn 50uMくらい(ZnのKdによる）で透析＞そのまま濃縮 とか？

(無題) 削除/引用 No.3793-11 - 2015/01/29 (木) 22:08:16 - MM WInter8様 透析で置換→濃縮 濃縮→透析で置換 濃縮→ピペットで添加 ピペットで添加→濃縮 ゲル濾過で置換→濃縮 いろいろ試しましたが、すべてダメでした。 やはり、亜鉛を介した架橋が原因ですかね。

(無題) 削除/引用 No.3793-10 - 2015/01/29 (木) 19:11:45 - WInter8 どうやって添加してますか？ ピペットで添加するとZnの局所濃度が上がって沈殿するのかもしれません。 タンパク質濃度0.1mMということは濃縮してますよね。 濃縮前の段階で加えるとか、透析で一晩かけるとかの方法を試されては？ それと亜鉛が結合するアミノ酸って結構な種類があるようですね。 酸性アミノ酸やシステインに限ったことではないようです。

(無題) 削除/引用 No.3793-9 - 2015/01/29 (木) 15:56:21 - MM おお様 アミノ酸類は効きそうですね。 前例のある結晶化条件から組成を変えるのは少し抵抗がありますが、試してみたいと思います。 BufferをAcetateに変えるのは、これまた前例の結晶化条件からかなり外れますので、できれば避けたいです。 mon様 この系統のタンパクでいくつか報告があり、すべてmMでした。プロトコールの引用先はだいたい共通ですが、間違っていたらそのうち誰かが気づいて修正しそうな気がします。 ちなみに濃度比ですが、タンパク質0.1mM程度に対して、ZnSO4を0.5mMです。3分子の亜鉛が結合するので、やや過剰量といったところです。

(無題) 削除/引用 No.3793-8 - 2015/01/29 (木) 15:26:56 - mon もしかして、ｍとu(micro)の誤植だったりしないかな？

(無題) 削除/引用 No.3793-7 - 2015/01/29 (木) 14:55:33 - おお Basic zinc acetate[edit] Heating Zn(CH3CO2)2 in a vacuum results in a loss of acetic anhydride, leaving a residue of basic zinc acetate, with the formula Zn4O(CH3CO2)6. This cluster compound has the tetrahedral structure shown below. This species closely resembles the corresponding beryllium compound, although it is slightly expanded with Zn-O distances ~1.97 vs ~1.63 Å for Be4O(OAc)6.[6] http://en.wikipedia.org/wiki/Zinc_acetate この辺が原因かなとかってに想像してみたacetate buffer だと防げるのかな。。。

(無題) 削除/引用 No.3793-6 - 2015/01/29 (木) 14:46:25 - おお pHが低い方がよさそうな気がするが、、、気のせいかも知れん。あとはアルギニンとかはいってたらもしかしたら防げるかなぁ、、、と空想もしている。プロとコールとして樹立されているんだったらまあその濃度の方がいいのかもしれませんが、わたしも感覚的にはそんなに高い濃度は必要なさそうな気もします。蛋白のmoleから比べてそんなにあげなくてもいいんじゃないっていう気がするし。

(無題) 削除/引用 No.3793-5 - 2015/01/29 (木) 14:41:48 - MM mon様 ありがとうございます。 逆のパターンですね。 zinc fingerだと構造維持にZnは重要そうですね。

(無題) 削除/引用 No.3793-4 - 2015/01/29 (木) 14:37:44 - MM WInter8様 ありがとうございます。 やはりその場合はタンパク質濃度を下げるか亜鉛濃度を下げるしか無いのでしょうか？ 文献情報で結晶化の実績がある濃度の組み合わせなのですが、再現できず、濃縮中に沈殿してしまいます。

(無題) 削除/引用 No.3793-3 - 2015/01/29 (木) 14:12:26 - mon 自分の経験ではありませんが、Zn figerモチーフを有するタンパクの結晶化を試みている方はZnCl2 1~10uM程度添加したbufferで精製していました。 その方はZnを入れないと凝集する（しやすい？）と言っていました。参考になれば。

(無題) 削除/引用 No.3793-2 - 2015/01/29 (木) 14:03:33 - WInter8 亜鉛結合タンパク質に限らず、亜鉛添加によって沈殿するタンパク質は多いですよ。 亜鉛が非特異的に分子表面の酸性アミノ酸側鎖に結合して架橋剤のように働くからだと思うのですが。

Znによるタンパク質凝集 削除/引用 No.3793-1 - 2015/01/29 (木) 10:44:27 - MM 活性サイトに亜鉛結合部位を持つタンパク質は、亜鉛(0.5mM程度)を加えた段階で凝集することが多いのですが、経験ある方いらっしゃいませんか？結晶化用で数mg/mL以上にすると顕著です。ちなみに亜鉛を含むbufferに置換するまでは、凝集しません。 回避する方法等あれば、ご教授いただけると助かります。 追記 凝集は亜鉛の溶け残りではなくタンパク質の凝集であることは確認しています。

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