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(無題) 削除/引用 No.3896-7 - 2015/02/27 (金) 05:21:10 - おお タッチダウンとかもやってみるといいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3896-6 - 2015/02/26 (木) 18:45:59 - AYN 皆さん回答ありがとうございます。 付属の説明書は確認したのですが、調べが甘かったようでお恥ずかしい限りです。 シークエンスの確認は外部委託になってしまい学生にはハードルが高いので、まずは温度条件とMgCl2濃度を変えて試してみます。 ご意見ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.3896-5 - 2015/02/26 (木) 15:48:04 - mon 色々試すのが面倒な場合、Mgを1.5x ,アニーリング温度を30℃,40℃,50℃で試してみてはいかがでしょうか。プライマーの計算上のTMは参考程度に考えてください。 GC-richだと5% DMSO添加も有効です。

(無題) 削除/引用 No.3896-4 - 2015/02/26 (木) 15:46:57 - ta クローニングにTaqを使ってはいけない理由はないので、Taqで増えるのならベクターに組み込んでシークエンスを確認して正しいクローンをとれれば、それでよいと思います。 アニーリングの温度や伸長時間の至適条件はTaqとKODでは異なるので、どうしてもKODで条件をみつけたいなら、アニーリング温度を振ってみる（グラジエント機能があれば楽）、伸長時間を長くする、シャトルPCRを試してみる、とかでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.3896-3 - 2015/02/26 (木) 15:46:10 - qw ＞試しにBioLabsのTaqを使ったら増幅できたので、 であれば、ひとまずそのPCR産物をクローニングしなさいね。 10クローンも拾えば、変異のないクローンがきっと入っていますから。 ここにもなんの条件も提示していないけど、KODの問題だとは到底思えませんね。 メーカーの東洋紡に聞いてみましたか？詳細な条件をメーカーに伝えれば可能な限り答えてくれると思いますがどうなんでしょうね。

(無題) 削除/引用 No.3896-2 - 2015/02/26 (木) 15:41:44 - mon KODシリーズには数種ありますが、どれでしょうか？ Manualにも書いてありますが、TaqとKODでbuffer組成（塩濃度）が異なるので、アニーリング温度はTaqより５〜１０℃低くしたほうが成功率が上がります。 Mgは1.25x, 1.5x, 2x濃度で振ってみましょう。Mgが高いとエラー率が上がるかもしれませんので、増えたもので最低濃度のものを使ってください。 また伸長反応温度も６８℃(Taqは72℃）が推奨されています。

PCRの失敗 削除/引用 No.3896-1 - 2015/02/26 (木) 15:20:33 - AYN イネから抽出したDNAを鋳型に約500bpの配列をPCRで増やそうとしているのですが、何回やっても増幅されません。どなたか知恵を貸していただけないでしょうか。 コンストラクトに使う配列なので、東洋紡のKODを使っています。 新品のKODを使っても失敗したので、酵素の失活が原因ではないようです。 試しにBioLabsのTaqを使ったら増幅できたので、プライマー設計や温度設定、鋳型に問題はないはずです。 MgCl2の最終濃度を1.0mMから1.2mMに上げる方法も試しましたが駄目でした。 毎回100bpより小さいバンドが薄く出るだけで、増幅産物のバンドは全く見られません。 何か改善方法はないでしょうか。よろしくお願いします。

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