全7件 ( 1 〜 7 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

ありがとうございました。 削除/引用 No.3910-7 - 2015/03/13 (金) 14:44:42 - ウエスタン初心者 やってみました。比率になって、ほかの論文と同じくらいの数値になってきました。ところどころ、おかしいくらい大きい数値のものもあるので、ＯＤ値を求める際の失敗かと考えてます。 バンドをみて濃い、薄いは合ってたので、数値までちゃんと見てなかったです。もう一度やってみます。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.3910-6 - 2015/03/03 (火) 05:33:58 - L そのタンパクのリン酸化を触媒する上流の経路の活性を評価したいのか、リン酸化タンパクの量をもってそのシグナル経路のアウトプット（下流への活性）の指標として見たいのか、によって、何を見るべきか変わってくると思います。トータルの値でリン酸化バンドの値を割るのは、前者の場合になると思います。後者の場合は、リン酸化バンドの値だけで良い（あるいは、ロードしたタンパク量を反映するコントロールの値で割る）と思います。もし、トータルのタンパク量に変化がないのであれば、トータルで割る事により、両方とも評価できる事になります。 Image Jをお使いになっているという事は、フィルムのスキャンで解析しているのかな、と思うのですが、この場合は、おおさんがおっしゃるように、リニアレンジが狭く、きちんとそのレンジにすべてのバンドが入っているかどうかわからないので、本来なら量が分かっているサンプルの希釈による標準曲線を作らないと、定量は難しいと思います。が、実際そのように定量している論文はほとんど見かけませんので、ある程度は許容範囲のようにも思うのですが、一応気をつけた方が良いと思います。定量目的であれば、蛍光二次抗体のシステム（おおさんがおっしゃっているCCDカメラで直接検出する方法です）やELISAなどを使った方が良いかも、です。

(無題) 削除/引用 No.3910-5 - 2015/03/03 (火) 02:08:43 - おお もしトータルの発現が大きく変わってなければリン酸か/トータルでだしてもいいかもしれません。トータルが半分になっていて、リン酸かが変わらないときに、二倍になったといっていい実験なのかどうかはよく考えるべきです。なのでまずはinternal control をベースにするか、総蛋白量ベースで数値を出した方がわたしはいいと思います。もちろんリン酸か/トータルでデータを処理している論文もありますから、まったくもってそれがだめであるとはいいません。 定量に関してはCCDカメラで直接検出したものであれば光の強度にたいして直線性のレンジの幅はひろいです。フィルムだとかなりそのレンジがせまく、そのレンジに入っているかを知るのが難しい場合がおおいです。そう言う場合は蛋白量を定量という言葉をさけ、バンドのintensityということでデーターをとります。直線性がないかもしれないですが、強ければ多い、弱ければ少ない(半定量)が成り立ちますから。 この場合注意しないといけないのはinternal controlやtotal の目的の蛋白のバンドのintensityで割ると、直線性がないので補正にならないことです。ただバンドのdensityがかなりに通っているなら直線性に入るレンジにすべて持っていきやすいのはたしかです。

(無題) 削除/引用 No.3910-4 - 2015/03/03 (火) 01:47:51 - イメジェ 名無しさんのおっしゃるように、目的のバンドの強度とコントロールのバンドの強度の比をとって比較します。このとき出すバンドの強度は、すべて同じ面積について出します。ウエスタンをするとこのように「定量して」と上司に言われますが、個人的にウエスタンのバンドから定量するのは好きではありません。バンドの形や露光の程度、バックグラウンドの有無、ImageJの使い方など、きちんと比較定量できるのか疑問です。みなさんどのようにやっているのか、気をつけていることなどあれば伺ってみたいところではあります。

(無題) 削除/引用 No.3910-3 - 2015/03/02 (月) 23:15:47 - 名無し リン酸化formのバンドのシグナル強度をトータルのその蛋白質のシグナル強度で割り算すればいいとおもうけど。その蛋白質あたりのリン酸化体の割合ということで。

(無題) 削除/引用 No.3910-2 - 2015/03/02 (月) 17:05:26 - おお 何が見たいか目的次第じゃないの?リン酸化型が活性型だったら、リン酸化型があがっていれば、細胞内に活性化型がふえてるわけですし、それでシグナルがより伝達されているという話ならtotalは下がっていても上がっていてもかまわないわけだし。 ちょっといいたいことをご自身で整理してみてください。

image J　によるＷＢの　ＯＤ値による定量について 削除/引用 No.3910-1 - 2015/03/02 (月) 16:56:25 - ウエスタン初心者 本当に初心者のため、よくわかりませんが、 現在ウエスタンブロットのバンドをＯＤ値にして、数値を求めました。 しかし、このとき、リン酸化のバンドとトータル量のバンドをどのように 処理するかがわかりません。 そこでウエスタンの定量で、まずトータル量を加味しているのかどうか、 している際は、どのように加味しているのかを教えていただけたらと思います。よろしくお願いいたします。

全7件 ( 1 〜 7 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---