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(無題) 削除/引用 No.3914-20 - 2015/03/04 (水) 19:08:37 - みかん 774様　おお様 ありがとうございます。 前任者の生データは残っていませんでした。 blankの値は、同じタイミングで5回同じものを測定しても650〜1000の間の値が出ます。

(無題) 削除/引用 No.3914-19 - 2015/03/04 (水) 17:58:12 - おお わたしは昔のプロメガのきっとで300あたりだったかなぁ。。。測定時間は忘れました。でエンハンサーレスのconstructで1000とか。バックグランドのばらつきが大きいのも気になりますね。 わたしも導入効率はが低い可能性が高いと思いますし、それは最初の方に指摘しましたが、もしそうでない可能性も少し視野に入れた方がいいかとおもっていろいろ可能性を考えているところです。 わたしは昔のプロメガのきっとで300あたりだったかなぁ。。。測定時間は忘れました。でエンハンサーレスのconstructで1000とか。バックグランドのばらつきが大きいのも気になりますね。 わたしも導入効率はが低い可能性が高いと思いますし、それは最初の方に指摘しましたが、もしそうでない可能性も少し視野に入れた方がいいかとおもっていろいろ可能性を考えているところです。 あまり得策ではないですが、バックグランドのnを増やすと平均がすべての測定値より下回るかもしれませんが、、、特に活性化されてない状態のデーターの時。バックグランドの数値で外れ値っぽい数字とかありますか(外せといっているのではなく、何が起こっているか考察するために)。

(無題) 削除/引用 No.3914-18 - 2015/03/04 (水) 17:41:29 - 774 導入効率が低い可能性が高い。には同意した上で。 BGが高すぎませんかね？ プロメガのDual lucの系だと100前後な気がします。 Luc assay用のキットも違いますし、測定時間もわからないので的外れかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3914-17 - 2015/03/04 (水) 17:19:51 - おお >[Re:15] lucさんは書きました : > lucの値が低すぎますね。 > トランスフェクション条件をまず検討すべきかと思います。 > 細胞はトランスフェクションされにくいのでしょうか？ベクターまたはトランスフェクション試薬のドーズを上げて見てはどうでしょう？ > トランスフェクション効率に関してはGFPなどの発現ベクターをトランスフェクションすればわざわざluc assayしなくても検討はできますので pcH110をつかっているでtransfectionの効率はそこから推測できるはずですが、前にやった人の生データーとか残ってないですか?そうすると系が働いている時数値がどんなもんか感覚がつかめるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3914-16 - 2015/03/04 (水) 16:46:05 - みかん おお様 丁寧なコメントありがとうございます。 試薬は先輩から引き継いでものですが、確認してみます。 luc様 コメントありがとうございます。 仰るとおり、一度トランスフェクション条件も見直してみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.3914-15 - 2015/03/04 (水) 16:40:41 - luc lucの値が低すぎますね。 トランスフェクション条件をまず検討すべきかと思います。 細胞はトランスフェクションされにくいのでしょうか？ベクターまたはトランスフェクション試薬のドーズを上げて見てはどうでしょう？ トランスフェクション効率に関してはGFPなどの発現ベクターをトランスフェクションすればわざわざluc assayしなくても検討はできますので

(無題) 削除/引用 No.3914-14 - 2015/03/04 (水) 16:32:49 - おお >[Re:12] みかんさんは書きました : > > blankですが、BertholdのLumat　LB9501を用いてLysis bufferで測定したところ、650〜1200程度の値を行き来しております。 > > 実際のサンプルの測定値は大体1000〜1500の間です。 原因はともかくプロモーターの活性を検出するには厳しい価だと思います。特にプロモーター活性があると期待している状況でそれだと、何かの理由で活性がはかれてないと思った方がいいと思います。プロモーターが活性化されてない状態でもいくらかはLuc活性が見られることがたいていで、バックグランドをひいてネガティブになるというのは経験上ほとんどないです。キットのLuc assayの反応溶液が弱っている可能性はないですよね?

(無題) 削除/引用 No.3914-13 - 2015/03/04 (水) 16:17:45 - みかん 失礼しました。 Accelatorを添加してpCH110のβ-galactocidaseを活性化して測定しているので、トランスフェクション効率も分かりますね。 補正は、 Galacton(lusiferinが含まれている)添加後の値/Accelater添加後の値 で行っています。

(無題) 削除/引用 No.3914-12 - 2015/03/04 (水) 16:09:59 - みかん 様々コメント頂き、本当にありがとうございます。 lacZでトランスフェクション効率が確認できるのは知ってましたが、今迄の当研究室の習慣的に、確認していなかったようです。 先輩の残したノートを確認しても、そのような痕跡はありませんでした。 しかし、トランスフェクション効率がの御指摘も頂きましたので、検出してみようと思います。 ありがとうございます。 blankですが、BertholdのLumat　LB9501を用いてLysis bufferで測定したところ、650〜1200程度の値を行き来しております。 実際のサンプルの測定値は大体1000〜1500の間です。

(無題) 削除/引用 No.3914-11 - 2015/03/04 (水) 13:49:39 - ルックルック 失礼いたしました。

(無題) 削除/引用 No.3914-10 - 2015/03/04 (水) 11:41:26 - おお LacZで補正をしていると思いますが、実際どんなLacZ検出方法でどれくらいの価が出てますでしょうか?

(無題) 削除/引用 No.3914-9 - 2015/03/04 (水) 11:12:17 - おお pCH110だからlacZでtransfectionの効率をみてるんじゃないかな。

(無題) 削除/引用 No.3914-8 - 2015/03/04 (水) 09:10:35 - ルックルック fireflyとrenillaの値はどのくらいですか？ blankなんて１００もいかないと思いますが、レポーターのlucの発現があまりに低い場合はトランスフェクション条件から検討すべきかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3914-7 - 2015/03/04 (水) 02:29:31 - おお なんか割り算多くていやだな、、、っていう印象があります。。。

(無題) 削除/引用 No.3914-6 - 2015/03/04 (水) 02:07:27 - みかん 皆様コメントありがとうございます。 教えて頂いた先輩は既に他研究室に移り、連絡がつながらない状況で、研究室内でレポーターアッセイを行っているのが私だけですので、個人的に算出法を様々調べはしたのですが、具体的な測定値の扱いを示しているものが見つからなかったので、書き込ませて頂きました。 トランスフェクション効率の可能性を指摘頂きましたので、検討させて頂きます。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.3914-5 - 2015/03/04 (水) 01:51:11 - おお しょうさいはそのキットを見てみないとわかりませんけど、要するに検出限界以下でたまたまマイナスになってしまうあたいをどう扱うかということだと思えますので、それはラボないで決めることかとおもいますけど。 ちょっとその系は詳しくないですが、ブランクのあたいを引いて負になるのは相当トランスフェクションの効率が悪そうな気がします。 そういう実験系の問題点などももう少し周りと議論した方がいいかと。

(無題) 削除/引用 No.3914-4 - 2015/03/03 (火) 23:59:50 - TK-1 そういうことは一緒に実験をしている研究室の先輩にまず聞いて、話し合いをするのが先。何でもネットに丸投げはよくないよ。

(無題) 削除/引用 No.3914-3 - 2015/03/03 (火) 23:20:41 - みかん 774様 コメントありがとうございます。 言葉が著しく不足していてすみません。 現在は、研究室の先輩に倣い、ルミノメーターを用いて得た値からblank(Lysis bufferのみ)の値を引いて、 Galacton添加後の値/Accelater添加後の値 の後にTOP/FOPの計算をして、さらに相対値を算出しております。 しかし、この計算ではマイナスの値になることがあり、一般的にはどう計算すべきなのかと疑問を抱いた次第です。

(無題) 削除/引用 No.3914-2 - 2015/03/03 (火) 21:22:39 - 774 実験する前に考えるべきことでしょう。 そんな状態で実験するべきではないと思います。

ルシフェラーゼレポーターアッセイ 削除/引用 No.3914-1 - 2015/03/03 (火) 21:09:32 - みかん ルシフェラーゼレポーターアッセイについて質問させて頂きます。 TOP Flash, FOP Flash, pcH110を細胞にトランスフェクションシ、Tropix(現Applied Biosystems)の試薬を用いてルシフェラーゼレポーターアッセイを行っております。 プロトコールは試薬の添付文書に掲載されていたのでその通りに従っているのですが、測定した値をどう計算すればいいのか迷っています。 一般的にはどう計算するものなのでしょうか? 御教授頂ければと思います。

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