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(無題) 削除/引用 No.3921-6 - 2015/03/10 (火) 08:32:39 - tora 皆さんアドバイスありがとうございました。 配列はあくまでデータベースで確認したものなので、間違っている可能性もあるんですね泣 もう一度さまざまな条件で検討して、無理なら新しくプライマー設計してみます。

(無題) 削除/引用 No.3921-5 - 2015/03/10 (火) 08:16:34 - ~ 1ヶ月ちかくはまった後で、 その配列がテンプレートにない (テンプレートのデータベース上の配列が誤っていた) ということがありました。 そもそも、あるはずの配列とは、ご自身で、 手持ちのサンプルを使って確認されたものでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.3921-4 - 2015/03/08 (日) 17:31:57 - おお 働くはずだけどどうもうまくいかないというのはPCRでは結構誰でも経験することだと思います。プライマー設計には当たりはずれがあるということだと思います。 ふやす目的は何なのかにもよるし、いろいろな可能性があるのでもう少し詳しいことが提示されないとなかなか適切なアドバイスがしにくいです。 １ｋとかそれぐらいの長さならもしかしたら ｃDNAをつくったあと RNaseHを処理するだけでドラスティックに変わることもあります。もし目的の遺伝子の一部の配列をプラスミドで持っているならそれを使ってプライマーが働くかはある程度チェックできます (もちろん少し環境が違うので難易度が違う可能性はあります ）。 RTのときのプライマーもランダムプライマーだとRNAとの量比を考えないと出にくくなる場合はあります。スペシフィックなプライマーを使ってみるのもてです。 思いつくことを書きましたが、最初に書きましたようにあなたの目的にあった解決方法なのかよくわかりません。

(無題) 削除/引用 No.3921-3 - 2015/03/05 (木) 21:15:22 - mon 増幅したい長さはどれくらいでしょうか。 長い配列を増やすプライマー配列の設計は難しくなります。 プライマーを30mer程度にして２step PCRで行うと成功率は上がります。 また、標的配列がGC-richあるいはAT-richなど偏っていても難しくなります。 この場合、添加剤を使ったり、最近の高性能酵素を使うと良いかもしれません。 クローニング目的で、どうしても成功しない場合はPCRを分割して増やしてから連結すると良いでしょう。 ppさんも指摘していますが、プライマーが結合する領域に運悪くSNPがあるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3921-2 - 2015/03/05 (木) 17:41:56 - pp 「あたるはずのプライマー」の根拠はどこでしょう？ 他の論文で使用されている実績のあるものでしょうか？ 自分でどこかのプログラムを使って設計したものなら、増えないことはよくあります。 新しく設計しなおしたほうが早いですよ。

PCRのプライマー 削除/引用 No.3921-1 - 2015/03/05 (木) 17:34:05 - tora 早速ですが質問です。 PCRのプライマーについてなのですが、確実にあるはずの配列をターゲットにプライマー対を作製したのですが、全くバンドが出ません。アニーリング温度もグラジエントにして、プライマーのTm値より5℃〜15℃低い範囲の間で2℃刻みで振ってみましたがバンドは全然出ません。ポジコンとしてGAPDHプライマーを使って反応させたものではバンドは出るので、サンプルにはｃDNAは含まれているはずです。ちなみにサンプルは目的遺伝子を大量に発現している組織からRNAを抽出して逆転写したものなので、目的遺伝子がないということもないと思います。 あたるはずのプライマーが当たらないことについて考えられる理由を教えていただきたいです。

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