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(無題) 削除/引用 No.3944-11 - 2015/03/17 (火) 13:06:29 - おお >[Re:9] はるきさんは書きました : > 今回WBで取ろうとしているデータは既に報告されている論文の再現性を確認することであり、 > 従ってローディングコントロールにそこまで細かく気を使う必要もないと思い、 報告されている論文と同じコントロールの取り方をするのが筋ではないですか？

(無題) 削除/引用 No.3944-10 - 2015/03/16 (月) 05:54:44 - L 教授の先生がおっしゃった事を私なりに解釈すると（誤解だったらごめんなさいね）、「コントロールを置け」というのは、ローディングコントロールではなくて、「ポジコン、ネガコンを置け」という事のような気がします。ローディングをそろえる事も大事ですが、抗体反応の特異性をきちんと確認しておく事も重要です。サンプルを２枚のゲルに分けてもいいから、それぞれのゲルにポジコン、ネガコンを１レーンづつ入れておいた方が良いように思いました。

(無題) 削除/引用 No.3944-9 - 2015/03/16 (月) 01:42:20 - はるき 今回WBで取ろうとしているデータは既に報告されている論文の再現性を確認することであり、今後サブミットするために使う重要なフィギュアにはなりません。 従ってローディングコントロールにそこまで細かく気を使う必要もないと思い、BCAで定量後ローディングを行い目的のタンパク質を検出しました。しかし教授からはどんなデータでも条件を可能な限り信用できるもので取れと言われ、再現性の確認であってもコントロールを置けとやり直しを指示されました。しかしコントロールを置くとサンプル数が多いため1枚のメンブレンに収まらず、どうすべきか迷っていたところでありました。 みなさんの意見を参考にすると、私の場合ローディング量が各サンプル毎に同じ量でアプライ出来ているかが最も重要なので、この場合リプローブして目的のタンパク質とコントロールを検出する。あるいは既に定量されているのだから、多少妥協して別々のメンブレンで目的のタンパク質とコントロールを検出する方法でも良いのかなと感じました。

(無題) 削除/引用 No.3944-8 - 2015/03/15 (日) 16:48:18 - おお >結局、プラクティカルにGAPDHとかb-actinとかよりも総タンパク量の方が変動が少ないからということなんでしょうけど、 そうとも限らないとはおもいます。細胞の状態、種類が変われば総たんぱくといっても細胞あたりでみるとちがうかもしれません。 悪く言えば各遺伝子が動くという指摘を避けるということかもしれませんし、複数のインターナルコントロールを見てみたが実際動いてそうだということになるなら、総たんぱくで合わすとしたほうが、データーを示しやすいとおもいます。 ＞転写後に各レーンの総染色強度からタンパク量を見積もるのと、ローディング前にBCAなんかでタンパク量を決定してから同量を流すのと、どちらも効率とか色々な問題を内含しているんだし、半定量程度のものと割り切ってやってるんだからどっちもどっちなんじゃないかと思ってしまいます。 究極どっちでもいいという判断は場合によってはそうだと思いますが半定量を絶対的な前提にしないほうがいいと思います。いまはフィルムじゃなくてカメラで HRPの発光を検出できるので。

(無題) 削除/引用 No.3944-7 - 2015/03/15 (日) 04:59:16 - L ローディングコントロールを置く目的について、ざっと考えると、 （１）BCAやBradfordでのタンパク定量が適切かどうかダプルチェック （２）SDS-PAGEからtransferまでの過程に問題がない事の確認 といったところかと思います。個人的には、ウエスタンした後のメンブレンをアミドブラックなどで染色して総タンパクを評価すれば、十分と思っており、ローディングコントロールのウエスタンは必ずしも必要ないと思っています。ただ、論文にする時などレビュワーがうるさいので、プラクティカルには、ローディングコントロールのウエスタンもリブロットした後でアミドブラック染色しています。総タンパクのロードに問題ないのにローディングコントロールのウエスタンが変動している時は、ローディングコントロールを変えます。アクチン、チュブリンなど細胞骨格系のコントロールでは、このようなケースが時折見られるので、細胞骨格系のコントロールは最近使っていません。 同一レーンの問題については、例えば100kDaのタンパクを検出したレーンで43kDaのアクチンをコントロールとして検出しても、100kDa付近のタンパクと40kDa付近のタンパクが同様に転写されているか不明です。よって、ローディングコントロールのウエスタンを同一レーンでやる事にこだわる意味はないように思います。総タンパクを同一メンブレンで見れば、目的タンパクのサイズあたりの転写を確認できます。ローディングコントロールはレビュワー対策でやっているような感じですので、異なるゲルに流す場合もあります。 いずれにせよ、ウエスタンでの定量は、不確定要素が多すぎるので、ローディングコントロールや総タンパク量で補正したとしても、参考値程度と考えています。どうしても定量が必要ならELISAを使います。ELISAも、厳密な意味での特異性が保証されていない場合がありますが、ウエスタンよりはよいと思います。

(無題) 削除/引用 No.3944-6 - 2015/03/14 (土) 20:38:26 - おしえてください >[Re:5] Fさんは書きました : > 私は、SDS-PAGE前に各cell lysateのタンパク定量をして、各レーンにアプライする > 総タンパク量を合わせるようにしています。 > それで、さらにb-actinなどのバンドもみてます。いちおう。 > > でも、最近、細胞のトータルタンパクをいっしょにして流せば、インターナルコントロールって > 必要なんだろうか、とよくおもいます。 別スレで内部標準の代替として総タンパクによる補正を行うことの理屈付けについて質問しました(No.3938-7 - 2015/03/13 (金) 12:29:37 - おしえてください)。 ご返答にあったURLの記述も読んだのですが、イマイチ腑に落ちないんですよね。 結局、プラクティカルにGAPDHとかb-actinとかよりも総タンパク量の方が変動が少ないからということなんでしょうけど、転写後に各レーンの総染色強度からタンパク量を見積もるのと、ローディング前にBCAなんかでタンパク量を決定してから同量を流すのと、どちらも効率とか色々な問題を内含しているんだし、半定量程度のものと割り切ってやってるんだからどっちもどっちなんじゃないかと思ってしまいます。 その点でいうと、定量に関してSimple Westernのシステムは魅力的におもいます。

(無題) 削除/引用 No.3944-5 - 2015/03/14 (土) 16:06:04 - F 私は、SDS-PAGE前に各cell lysateのタンパク定量をして、各レーンにアプライする 総タンパク量を合わせるようにしています。 それで、さらにb-actinなどのバンドもみてます。いちおう。 でも、最近、細胞のトータルタンパクをいっしょにして流せば、インターナルコントロールって 必要なんだろうか、とよくおもいます。 特に、最近扱うのは、薬剤処理した細胞が多いので、細胞の形態が変わってたり、死にかけになって いる細胞だったり、解糖系が変わってたり、そんな条件ですので、アクチンやガPDHが適切なのかどうか。。 逆にそれらを基準にデータ取ると、ミスリードになってしまうんでは、とおもったり。 それぞれの条件で変動しない適切なコントロールを見つけ出すべきなんでしょうが、 このコンテキストでいう”適切な”内部コントロールを厳密に定めるのも結構難渋しますよね。

(無題) 削除/引用 No.3944-4 - 2015/03/14 (土) 15:13:20 - おお >[Re:1] はるきさんは書きました : > > 従って、Aのメンブレンで目的のタンパク質を検出し、BのメンブレンでローディングコントロールとしてAとBを比較するのは妥当のように思えるのですが、これは実験データの信頼性を損なわないものでしょうか？(AとBのメンブレンは別々に泳動するものと仮定しています。) > > またローディングコントロールと検出したいタンパク質は同一レーンで検出しなければならないのでしょうか、それとも別々のレーンで流しそれぞれ単独で検出すればよいのでしょうか？ わたしはべつの膜でも、べつのレーンでもいいかと思っています（ただしなにをもってローディングコントロールとかんがえるかにもよります ）。リプロービングでどれだけ定量性が維持できるのかという質問をここで投げかけたこともありますが、結論は出なかったというのもあります。また見る淡白がいろいろあるとき、おのずとひとつの膜だけでは足りないこともあるかもしれません。 たとえば WBでなくって、膜転写後特別な処理をしないといけなくその後インターナルコントロールで染めれないなら、２枚用意したりするのもかんがえられる手です。 またまったくそういうえい動しないケースでも、得られたライセートを酵素活性をはかったとき、その溶液から実際の淡白量を見積もらなければならないとはいえないわけです。ｑPCRも同じ反応チューブからインターナルとテスト両方増やしません。 ただ、ただしなにをもってローディングコントロールとかんがえるかにもよると申し上げたように、そのレーンが適切に流れてトランスファーされているかなど示したいなら transfer後に総淡白をそめてそれをデーターとしてとることはできます。

(無題) 削除/引用 No.3944-3 - 2015/03/14 (土) 14:26:47 - はるき >またローディングコントロールと検出したいタンパク質は同一レーンで検出しなければならないのでしょうか、それとも別々のレーンで流しそれぞれ単独で検出すればよいのでしょうか？ >ローディング量を保証するためですから、別レーンを参照しても意味はありません。 同一レーンで比較するということは、検出したいタンパク質とローディングコントロールの両方のバンドを検出しなければならないということになりますよね？ そうなると1次抗体はローディングコントロールと目的のタンパク質の両方の抗体をメンブレンに載せることになりますが、それぞれの1次抗体同士で結合が起きメンブレンへの結合が阻害されるといったことはないのでしょうか？ またローディングコントロール、検出したいタンパク質とも1次抗体はモノクローナル抗体を使用していますが、 2種類の抗体をメンブレンに載せることで検出時にバックグラウンドが高くなるといったことは懸念されるのでしょうか？

一度の露光でやる必要はない 削除/引用 No.3944-2 - 2015/03/14 (土) 09:42:41 - 774R >例えば転写率の悪いタンパク質をECLで検出しようとすれば、露光時間は長くなることが予想されます。しかしGAPDHやβ-actinは数秒の露光時間でも十分検出でき、時間が長すぎると酷いハレーションを起こしてしまいます。こうなるとローディングコントロールと目的のタンパク質の検出はそれぞれにあった露光時間で撮影すべきであるため、同一メンブレン内で比較することに拘る意味がないように思えます。 よくやるのは、メインの抗体がウサギの抗体だとしたら、そのバンドの露光が終わった後、リプローブと言って、抗体を剥がしてからマウスのGAPDHやアクチンの抗体でWBするという方法ですね。 あるいは、見たいバンドとコントロールのバンドの位置が違う場合は、最初にメンブレンを切ってから別々にWBすることもあります。 >従って、Aのメンブレンで目的のタンパク質を検出し、BのメンブレンでローディングコントロールとしてAとBを比較するのは妥当のように思えるのですが、これは実験データの信頼性を損なわないものでしょうか？(AとBのメンブレンは別々に泳動するものと仮定しています。) ローディングや転写の誤差を補正、あるいは均一であることを示すためのローディングコントロールですから、別のメンブレンでやっては意味はありません。 >またローディングコントロールと検出したいタンパク質は同一レーンで検出しなければならないのでしょうか、それとも別々のレーンで流しそれぞれ単独で検出すればよいのでしょうか？ ローディング量を保証するためですから、別レーンを参照しても意味はありません。

ローディングコントロールに関する質問 削除/引用 No.3944-1 - 2015/03/14 (土) 07:27:43 - はるき ウェスタンブロッティングにおけるローディングコントロールに関する質問です。 電気泳動をする際ローディングコントロールは同一ゲルで流し、同一メンブレンに転写しなければコントロールとし て意味を持たないのでしょうか？ 例えば転写率の悪いタンパク質をECLで検出しようとすれば、露光時間は長くなることが予想されます。しかしGAPDHやβ-actinは数秒の露光時間でも十分検出でき、時間が長すぎると酷いハレーションを起こしてしまいます。こうなるとローディングコントロールと目的のタンパク質の検出はそれぞれにあった露光時間で撮影すべきであるため、同一メンブレン内で比較することに拘る意味がないように思えます。 従って、Aのメンブレンで目的のタンパク質を検出し、BのメンブレンでローディングコントロールとしてAとBを比較するのは妥当のように思えるのですが、これは実験データの信頼性を損なわないものでしょうか？(AとBのメンブレンは別々に泳動するものと仮定しています。) またローディングコントロールと検出したいタンパク質は同一レーンで検出しなければならないのでしょうか、それとも別々のレーンで流しそれぞれ単独で検出すればよいのでしょうか？

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