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ありがとうございます 削除/引用 No.3962-16 - 2015/05/16 (土) 03:20:26 - mouse コメント頂き有り難うございます。 交配については、両方向の交配を(母Cre/+マウスと父Dicer flox/floxマウス、父Cre/+マウスと母Dicer flox/floxマウス）を行っていました。 前任者の交配では、父Cre/+と母Dicer flox/floxからの胎仔が、Cre wild/wild; Dicer del/wildとなる場合が散見されており、遡ってgenotypingが正確であったかどうかを確認したいと思っておりますが、こういった事が遺伝学上ありうる事であるのかどうかについて、コメント頂けましたら幸いです。

(無題) 削除/引用 No.3962-15 - 2015/05/06 (水) 14:33:14 - AP 交配の向き(父母をそれぞれどちらの系統にしたか)、正・逆交配で確かめたか？ female germ line特異的Cre遺伝子をもつ系統を母とした交配であれば、卵の遺伝子型が減数分裂の結果としてCreをもつか持たないかに関わらず、oogenesis のあいだに発現したCreが卵に蓄積されているということで説明がつきます。母性効果、母性遺伝というやつで、珍しくない現象です。

その後 削除/引用 No.3962-13 - 2015/05/06 (水) 12:45:06 - mouse 皆様のアドバイスのお陰で、見かけ上WTに見えていたものは、del/+であった事を確認できました。 大変ありがとうございました。 ただ、過去の交配表を見直していた所、疑問点が出てきましたので、コメントを頂ければ大変助かります。 初めて、Cre+マウスと Dicer flox;floxマウスをかけた際に、この交配からの胎仔の一部に既に、Cre+; Dicer del/wildが認められました。この原因としては、Creが受精卵の時点で発現してしまい、systemicにDicerのdeletionが起こったと考えて良いでしょうか？ 更に、実はこの交配から一匹Cre-; Dicer del/wildが生まれたのですが、これは遺伝学的にあり得ることなのでしょうか？単なるgenotypingのミスという事なのでしょうか？ コメント頂ければ幸いです。

ありがとうございます 削除/引用 No.3962-12 - 2015/03/26 (木) 10:54:03 - mouse ありがとうございます。早速取りかかりたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.3962-11 - 2015/03/26 (木) 10:47:32 - cc 元の論文はこれですよね、おそらく。 http://www.pnas.org/content/102/31/10898.long 今まで使っているプライマーがPCR産物の長さから論文で使用されているものと同じだと思いますので、forwardのプライマーとCCTGAGCAAGGCAAGTCATTCで増やすと、Creでとばされた場合は471bpの産物が得られるようです。

お返事有り難うございます 削除/引用 No.3962-10 - 2015/03/26 (木) 10:36:33 - mouse 皆様、またまたレスを頂き有り難うございます。 Lさん、 （１）、（３）、（４）は全ておっしゃる通りです。 （２）wtとfloxで異なるプライマーペアを用い、それぞれ別のチューブでPCRをかけているという事でよろしいでしょうか？ ー＞一つのプライマーペアで一つのチューブでのPCRです。loxP siteの有無で長さが違うバンドが出るので、WTに比べてfloxは少し長いバンドが出ます。 floxのPCRが何らかの理由でかからなくなっているサンプルがある可能性、flox/floxと判断されている親マウスにおいて片方のfloxアレルに問題がある可能性（例えば、一方のアレルが欠失してflox/-になっていても、PCRではflox/floxと区別がつかず、この場合結果として生まれてくるpupsの半分はwt/-となりwt/wtと区別がつかない）、などを考えます。 ー＞私も同様の可能性を考えておりますが、PCRに関しては同じlitterの中にへテロのサンプルもいて、それは綺麗に検出出来ているのでPCR errorの可能性は低いのではと思っています。 ccさん とばしたあとの配列を確認するプライマーもあるようですし、本当にWTなのかCreが作用してしまったのか確認するのが確実で早いのではないでしょうか。 ー＞飛ばした後の配列を確認するプライマーというものについてもう少し詳しく教えて頂いても宜しいでしょうか。これは loxPで挟まれた領域の両外側にprimerをdesignするという事で良いでしょうか。そうすると、WT,Flox alleleでは二つのprimerが離れすぎていてPCRがかからず、deletionが起こればPCRがかかるのかなと考えたのですが。 皆様のコメント参考になります。 また、よろしくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.3962-9 - 2015/03/26 (木) 08:32:14 - L 何点か確認させて下さい。 （１）genotypingはすべてtailで行っている（理論上はfloxかwtのいずれかとなり、組換わったアレルは存在しない）という事でよろしいでしょうか？ （２）wtとfloxで異なるプライマーペアを用い、それぞれ別のチューブでPCRをかけているという事でよろしいでしょうか？ （３）結果、wtアレルだけが増幅された場合をwt、wtとfloxの両方が増幅された場合をhet、と判断しているという事でよろしいでしょうか？ （４）交配は、wt/wt Cre+ と　flox/flox Cre-　の間で行ったと理解してよろしいでしょうか？ もし、上記４点がその通りであれば、floxのPCRが何らかの理由でかからなくなっているサンプルがある可能性、flox/floxと判断されている親マウスにおいて片方のfloxアレルに問題がある可能性（例えば、一方のアレルが欠失してflox/-になっていても、PCRではflox/floxと区別がつかず、この場合結果として生まれてくるpupsの半分はwt/-となりwt/wtと区別がつかない）、などを考えます。 もし（２）でプライマーを４つ全部、一つのチューブに入れてPCRをかけているのであれば、wtとfloxのPCRを分けてかけてみてはどうでしょうか？　全部一緒に入れると、何らかの競合でfloxのPCRがかかりにくくなっているかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3962-8 - 2015/03/26 (木) 08:31:22 - cc >[Re:6] mouseさんは書きました : > Creのleak、deletionの可能性も考えましたが、このDicerがWTだった胎仔はCreは入っていなかったので、germlineでのleakの影響はないのではと思っております。 なんらかの原因でCreが卵細胞に残っていた可能性もあるかと思います。 Creでとばしたあとの配列は使っているプライマーでは増幅できず、ヘテロでも見かけ上WTになることは、文面からご存知だと思います。 とばしたあとの配列を確認するプライマーもあるようですし、本当にWTなのかCreが作用してしまったのか確認するのが確実で早いのではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.3962-7 - 2015/03/26 (木) 05:19:17 - おお Creが卵母細胞になる系列に効いてない可能性 ヘテロがあなたの系で胎生致死の可能性 Creが00%効いてない可能性 Creで飛んだアレルをもった細胞が卵母細胞にならないか、なったとしても機能しない可能性 単にヘテロが欲しかったら、もっといい方法がありそうだが、、、

コメントありがとうございます 削除/引用 No.3962-6 - 2015/03/25 (水) 23:40:08 - mouse 皆様、コメント大変ありがとうございます。 説明不足の点がありましたので、一部補足させて頂きます。 Systemic KOではなく、Cre-loxPシステムを使ったconditional KOマウス（http://jaxmice.jax.org/strain/006366.html)で、genotypingでは、wild bandとmutant band(flox allele)が検出出来るようなプロトコールを使っています（WT 351bp,HO 420bp, HE 351+420bp)。このストレインを単独で維持していたときにはそのプロトコールでWT,HE,HOの全てが鑑別出来ていました。ただ、このストレイン（flox/floxマウス）を女性生殖器系に特異的なCreと交配した所、理論上は全てHEになるはずが、約半分の胎仔がWTだったということです。このgenotypePCRの際にもWT,HE,HOのコントロールを全てそろえてやっており、PCRがworkしていることは確認しております。 Creのleak、deletionの可能性も考えましたが、このDicerがWTだった胎仔はCreは入っていなかったので、germlineでのleakの影響はないのではと思っております。 この問題の解決のために皆様のお力を頂ければと思いますので、よろしくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.3962-5 - 2015/03/25 (水) 15:58:53 - おお 全部 ｗｔですか？ ｗｔとｍuが混在している状態で、muが競合などの理由で検出されにくい状態になっている可能性はないですか？ mutant specific なぷらいまーで確認できませんか。

(無題) 削除/引用 No.3962-4 - 2015/03/25 (水) 13:49:59 - AP >DIcerノックアウトマウスの交配をしているのですが、Dicer homozygousとwildの交配から http://jaxmice.jax.org/strain/006366.html DicerのKOは胚致死と書いてあるのでホモ接合体は存在しないはずですね。 Cre-loxP組換えをかけていないノックインの状態のことですか？

(無題) 削除/引用 No.3962-3 - 2015/03/25 (水) 13:14:31 - TK-1 germlineでleakyに飛ぶCreを使っている？ Flox/Floxではなく、Flox/delになっていて、WTにかけて　WT/delができた時にきっちりとスクリーンできていない？

(無題) 削除/引用 No.3962-2 - 2015/03/25 (水) 13:06:17 - AP genotypingはどういうふうにやっているのですか？特に、wtとKOの区別のつけかたの実験デザインはどうなっていますか。ヘテロ接合のときに、何らかの原因で（例えば競合によって）wtしか検出できていないんじゃないかと疑っています。

homoとwildの交配から、wildが産まれた 削除/引用 No.3962-1 - 2015/03/25 (水) 12:44:28 - mouse 現在、B6.Cg-Dicer1tm1Bdh/JをベースとしたDIcerノックアウトマウスの交配をしているのですが、Dicer homozygousとwildの交配からwild typeが出てくるという結果に遭遇しました。 pupsのreclipped tailからのgenotype、親のreclipped tailからのgenotypeを再度しましたが、結果に間違いがありません。 この場合、何の可能性を想定したらよいのでしょうか。一時的に、他の親マウスがケージに入っていたという可能性も否定はできませんが、同様の事態が３つの異なるmatingから生じており、困っております。

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