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(無題) 削除/引用 No.4074-18 - 2015/05/15 (金) 12:48:00 - mon 遺伝子導入しているなら、3xFLAGタグを付けた方が早いかも。

(無題) 削除/引用 No.4074-17 - 2015/05/14 (木) 22:41:26 - 免沈乙 IPが上手くいかないのは、その大部分は抗体がいけてないからだとおもいます。なのでやっぱここは抗体を買い替えた方がよいとおもいます。IP可と書いてあって出来ればデータも出ているものが良いです。でもそういうのでも実際はできないものもよくあります。WBやICC,IHCはすごいよくてもIPは全然とかそういうのはふつうにあります。IPに使うには抗体がavidityていうか結合の強さが一定以上のものでないと安定な免疫複合体を形成するのが難しいらしいです。WBとかはとりあえずそれなりに反応してくっついたものが残っていれば検出もかなり高感度ですしシグナルはふつうにみえるのでそういうことにあまり気がつかないですが。

(無題) 削除/引用 No.4074-16 - 2015/05/14 (木) 15:44:15 - おお まあCo-IPでimmunocomplexesを見ることが多いでしょうから、そう言う意味では変性させてしまうと物はpull downできてもcomplexesは見れず役に立ちませんけどね。

(無題) 削除/引用 No.4074-15 - 2015/05/14 (木) 14:20:49 - 横 ありがとうございます。 そうなんですねえ。初めて知りました。とてもよく考えられたことですね。 これまでWBにしか使えず、IPには使えないと思っていた抗体も、このようなトリックがあればひょっとしたらIPできていたということも十分あり得そうですねえ。大変勉強になりました。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.4074-14 - 2015/05/14 (木) 14:12:36 - おお >[Re:13] 横さんは書きました : > 横から失礼… > 興味深く読まさせてもらっています。 > 低濃度のSDSを使って免疫沈降を試すというのは、SDS-PAGEで使える抗体を免疫沈降で使えない場合に、低濃度のSDSで処理したサンプルから免疫沈降すれば免疫沈降される可能性がある、というのが理論的根拠でしょうか？ WBで検出できるが、変性されていない状態では抗体がつかないので、一度1%位のSDSで変性させてやると抗体がつくようになるのではという推測です。 おそらくnativeな蛋白の構造上、抗体のエピトープが表面に露出してないとか、ほかの蛋白とコンプレックスを作っていて抗体が入り込めないとか。 後者の場合は1%のSDSの処理は場合によっては必要でなく、直接RIPA bufferとかでも解決するかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.4074-13 - 2015/05/14 (木) 07:41:13 - 横 横から失礼… 興味深く読まさせてもらっています。 低濃度のSDSを使って免疫沈降を試すというのは、SDS-PAGEで使える抗体を免疫沈降で使えない場合に、低濃度のSDSで処理したサンプルから免疫沈降すれば免疫沈降される可能性がある、というのが理論的根拠でしょうか？

(無題) 削除/引用 No.4074-12 - 2015/05/06 (水) 21:38:45 - おお >ProteinGがFBS中のIgGを拾っている可能性はないですか？ あ、これが原因かも。ま、変性させるとじょがいされるかな。proteinGなどでpre-treatもありですね。

(無題) 削除/引用 No.4074-11 - 2015/05/06 (水) 20:18:48 - mon >ダブルチェックですが、おおさんは1%SDSで処理すると仰っていましたが、monさんは0.1%でしょうか？ 1%SDS中で機能するIgGはないと思います。おおさんの提案のように1%で処理->0.1%に希釈してIP、という意味です。1% TritonX100でも結合できない抗体もあるようですし、より変成作用の強い0.1%SDSでは結合できない抗体も多いかも。

(無題) 削除/引用 No.4074-10 - 2015/05/06 (水) 18:47:29 - 凹気味 monさん IPに使う抗体はgoatとrabbit由来のものです。IP産物を抗goat抗体-HRPや抗rabbit抗体-HRPでIBするとぼこっとIP産物に現れ、unbound（IPされなかった上清）画分にはそのbandはほとんど見えないので、FCS由来のIgGは（落としてるかもしれないですが、）問題なさそうです。 ダブルチェックですが、おおさんは1%SDSで処理すると仰っていましたが、monさんは0.1%でしょうか？ エピトープがマスクされてるという発想はありませんでした。ありがとうございます！ 独り言さん phostag gelというものがあるんですね！タンパク質をIPして、その後、PY20でチロシンリン酸化を見る予定ですが、確かにproduct sheetのように上手く行くのならすごいテクニックですね。ありがとうございます。勉強になります。まずはIPを成功させてから、それで上手く行かなければ試してみます！

(無題) 削除/引用 No.4074-9 - 2015/05/06 (水) 16:59:34 - 独り言 本題とは関係なくなりますが、リン酸化を見たくてWBできる抗体があるのであれば、phostag gelを試してみたらいかがでしょう。 タンパク質によりますが、うまくワークするとかなりはっきりしたリン酸化シフトが見られます。

(無題) 削除/引用 No.4074-8 - 2015/05/06 (水) 15:58:23 - mon ProteinGがFBS中のIgGを拾っている可能性はないですか？ この場合、先にProteinGビーズにIP用IgGを結合させてから、培地に混合すると改善するかもしれません。 また、培地中の成分（タンパク？）がエピトープをマスクしている可能性もあります。 これなら、おおさんの提案の0.1% SDSが効くかも（ただし、SDSに敏感な抗体もありますよ）。

(無題) 削除/引用 No.4074-7 - 2015/05/06 (水) 14:19:27 - 凹気味 おおさん すっごくためになるsuggestionをいただきありがとうございます！！ RIPAbufferって元々はそういうために開発されたものなんですね。 RIPAで調べたらradioisotope labeled IPと出てきてとても驚きました！！ ありがとうございます！さっそくやってみます！！ 凹気味

(無題) 削除/引用 No.4074-6 - 2015/05/06 (水) 13:49:06 - おお >[Re:5] 凹気味さんは書きました : > おおさん、早速ありがとうございます！！ > 分泌タンパク質のリン酸化を見たいだけなので変性条件でも大丈夫だと思ってます！ > 0.1% SDSで抗体は失活しないんですね！！ > > 10% SDSのストック溶液があるんで、10分の1量を加えたらいいですね。しかしそこから更に10倍希釈となると・・15 mlファルコンチューブ内での抗体とインキュベートになりそうですね。それか全体の量を減らすか・・ 培地を直接WBでバンドが見えるわけですよね。たとえば15ul流してたとして、150ulをIPにまわしても10倍ですよね。IPの効率が100%なら10倍量ながせますよね。 その培地のなかの血清などの量によるかもしれませんけど、0.5%ぐらいのSDSでも何とかなるかもしれません。 RIPAbufferというのがあって、アイソトープラベルした抗体で検出するIPで使われたものですが、その組成はTBSなどに1%TX100 (or NP-40)、0.1-0.5% deoxycholateと0.1%SDSがはいっています。混合されたdetergentsによりSDSの変性作用も押さえられているようです。まあすべての抗体でOKかは微妙ですが、ポリクロなら大丈夫なことが多いかと思います。 1%SDSを薄める際にRIPA bufferの組成になるように調製することで、IPが可能になるということになります。 > 1% SDSで室温変性させる場合には1時間程度rotateしておけば十分でしょうか？ > そこら辺はタンパク質にも依るのかもしれませんが・・ 1時間ぐらいで十分でしょうね。もう少し短くてもいいかと。できればon ice のほうがいいかもしれませんがSDSが沈殿する可能性があります。sample bufferの時のように加熱できれば数分でいいし、プロテアーゼなどによる分解とか気にしなくてもいいので、少量の培地にSDSを加えて加熱して沈殿ができないか確認してみてもいいかもしれません。 ちなみにこの方法はユビキチン化した蛋白を抗ユビキチン抗体でIPする場合、ユビキチン化されてないけどユビキチン化された蛋白に結合してco-IPされる蛋白をのぞいて、コバレントにUbが結合した蛋白だけを回収する方法などでつかわれています。

(無題) 削除/引用 No.4074-5 - 2015/05/06 (水) 13:19:26 - 凹気味 おおさん、早速ありがとうございます！！ 分泌タンパク質のリン酸化を見たいだけなので変性条件でも大丈夫だと思ってます！ 0.1% SDSで抗体は失活しないんですね！！ 10% SDSのストック溶液があるんで、10分の1量を加えたらいいですね。しかしそこから更に10倍希釈となると・・15 mlファルコンチューブ内での抗体とインキュベートになりそうですね。それか全体の量を減らすか・・ IPバッファーは洗浄にしか用いていませんが、0.1% Tween20 in TBSです。 1% SDSで室温変性させる場合には1時間程度rotateしておけば十分でしょうか？ そこら辺はタンパク質にも依るのかもしれませんが・・

(無題) 削除/引用 No.4074-4 - 2015/05/06 (水) 10:12:53 - おお IPバッファーは具体的になんですか?バッファーの組成。

(無題) 削除/引用 No.4074-3 - 2015/05/06 (水) 10:11:04 - おお あとは硫安沈殿、溶解、透析、IPっていうのもありますけど、、、

(無題) 削除/引用 No.4074-2 - 2015/05/06 (水) 09:58:18 - おお 変性させてもいいんですか、、、 それなら1%SDSを加えてしばらくincubationして(またはSDS存在下で熱変性させて、ただし熱変性は血清が入ってたり蛋白量が多すぎると沈殿することがありますが)10倍りょうのTBS 0.1% deoxycholate 1%Tx-100を加えてからIPとか、 ワークしている研究室に問い合わせるのがいいかとおもいますけど、、、

免沈できません… 削除/引用 No.4074-1 - 2015/05/06 (水) 09:13:45 - 凹気味 論文で頻繁に使われてるサンタクルズの抗体を買って免沈を試してるんですが、落ちてきません… この抗体は自分のラボでホルマリン固定した細胞の蛍光免疫染色やウエスタンには綺麗に使えてます。たぶんこの抗体は変性条件のものを認識してるんだと思うんですが、かなり色んなラボで免沈に使ってるんですよね… そのタンパク質は分泌タンパク質です。ちなみに自分は293Tに過剰発現させて、４８時間後の培養上清からIPしています。IPしなくてもその培養上清を濃縮せずそのままSDS-PAGEにしてもきちんと検出されてます…IPをしてる論文を探しても条件が書いていないんですよね。 変性条件下でIP出来そうな気もしますが、IPの抗体が死んでしまわないか気になります。 皆さんはどのようにされていますか？あるいはIPの工夫等ありましたら教えてください！ サンプルは以下のように調製してます。 293Tに遺伝子導入→48時間後に培養上清をスピンダウンして不溶性のものを除いた後に、終濃度500mM NaCl, 1% Triton X-100になるようにストックソリューションを加え、抗体を3マイクログラム加えて、４度でオーバーナイトインキュベートしています。→IPバッファーで洗浄したProtein Gを加え、更に２−３時間４度でインキュベートしてからSDSサンプルバッファーで溶出してます。 500mM NaCl, 1% Triton X-100を培地に加えてますが、加えなくてもIPされてきません… Protein Gは抗体をほぼ１００％キャプチャーしています。培地をそのままSDSページしても見れるので上清中には大量のものがあると確信してます。トランスフェクトしてない293T培養上清ではそのバンドは見られないので、SDSページで見てるシグナルは本物です。

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