Bio Technical フォーラム

  • バイオ関連の実験をする上での、試薬、機器、プロトコールなどの情報交換の場です。
  • 新しいテーマで話を始める場合、質問をする場合は「新しいトピックを作る」から書き込みをしてください。
  • 質問に対して解答できる方は是非、書き込んで下さい。
  • このフォーラムにふさわしくないと管理人が判断した投稿は予告なく削除します。

新しいトピックを作る　|　トピック一覧　|　研究留学ネットに戻る

ひとつ前のフォーラム（readのみ）

このスレッドをはてなブックマークに追加このスレッドをはてなブックマークに追加

Elisa用タンパク抽出液（自作） トピック削除
No.4259-TOPIC - 2015/07/11 (土) 06:43:38 - 小児科医師（ゆとり教育）
いつもお世話になっております。

培養細胞(SH-SY5Y)からタンパクを抽出し、Elisa、ウェスタンブロットを行う実験を新たに始めるところです。タンパク抽出液にInvitrogen FNN0011を検討していたのですが、組成が公開されており買うのももったいないと思って自作しようとしたら、EGTA、NaF、Na4P2O7、Na3VO4といろいろと試薬がありませんでした。

細胞は実験を始めないといけない状態になっており、上記の試薬が研究室にないことが判明したのが金曜日の１８時で、周りの研究室（複数）に聞いて回ったのですがいずれも持っていませんでした（平日は臨床や講義で試薬を調べる時間がありませんでした）。卸業者に至急、FNN0011を持ってきてもらおうとしたのですが在庫を持っていないそうで無理でした。

日曜日にはタンパクを回収しないといけないので、他のプロトコールを探していてAbcamのELISA sample preparation guideをみつけました。

ELISA sample preparation guide
ttp://www.abcam.co.jp/protocols/elisa-sample-preparation-guide-1

Cell/tissue extraction buffer recipe
100 mM Tris, pH 7.4
150 mM NaCl
1 mM EGTA
1 mM EDTA
1% Triton X-100
0.5% Sodium deoxycholate
Additional reagents required to produce complete extraction buffer.
Phosphatase inhibitor cocktail
Protease inhibitor cocktail
PMSF

上記がその組成ですが、これだとEGTA以外の試薬はあります。ここで質問なのですが、

１．EGTAがなくてもタンパク抽出液として機能するか？
２．もしEGTAをなしでやるとするとEDTAを２倍にしたほうがよいか？
３．EGTAの代わりになる他の試薬があるか？またその濃度は？
４．このcell extraction bufferはウェスタンブロットにも使えるか？

以上につきまして、アドバイス賜りますと幸いです。
　
- このトピックにメッセージを投稿する -



全3件 ( 1 〜 3 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用
No.4259-3 - 2015/07/11 (土) 23:17:55 - 小児科医師（ゆとり教育）
おおさん、ご回答ありがとうございました。おかげさまで心強く、明日の実験に臨むことができます。今後もご指導よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用
No.4259-2 - 2015/07/11 (土) 15:37:48 - おお
>[Re:1] 小児科医師（ゆとり教育）さんは書きました :
> いつもお世話になっております。
>
> 培養細胞(SH-SY5Y)からタンパクを抽出し、Elisa、ウェスタンブロットを行う実験を新たに始めるところです。タンパク抽出液にInvitrogen FNN0011を検討していたのですが、組成が公開されており買うのももったいないと思って自作しようとしたら、EGTA、NaF、Na4P2O7、Na3VO4といろいろと試薬がありませんでした


NaF、Na4P2O7、Na3VO4はPhosphatase inhibitor cocktailのなかに入っているか、同様の効果があるものが入っていると思います。


>
> １．EGTAがなくてもタンパク抽出液として機能するか？
Yes

> ２．もしEGTAをなしでやるとするとEDTAを２倍にしたほうがよいか？
する必要はあまり感じませんがしてもいいでしょう。


> ３．EGTAの代わりになる他の試薬があるか？またその濃度は？
お気づきでしょうけどEDTAはある程度代用になり得ます。カルシウム依存のプロテアーゼの阻害を考えるならprotease inbihitorsでもおぎなえる可能性があります。


> ４．このcell extraction bufferはウェスタンブロットにも使えるか？
Yes. 組成はいわゆるSDS free RIPA bufferです。

Elisa用タンパク抽出液（自作） 削除/引用
No.4259-1 - 2015/07/11 (土) 06:43:38 - 小児科医師（ゆとり教育）
いつもお世話になっております。

培養細胞(SH-SY5Y)からタンパクを抽出し、Elisa、ウェスタンブロットを行う実験を新たに始めるところです。タンパク抽出液にInvitrogen FNN0011を検討していたのですが、組成が公開されており買うのももったいないと思って自作しようとしたら、EGTA、NaF、Na4P2O7、Na3VO4といろいろと試薬がありませんでした。

細胞は実験を始めないといけない状態になっており、上記の試薬が研究室にないことが判明したのが金曜日の１８時で、周りの研究室（複数）に聞いて回ったのですがいずれも持っていませんでした（平日は臨床や講義で試薬を調べる時間がありませんでした）。卸業者に至急、FNN0011を持ってきてもらおうとしたのですが在庫を持っていないそうで無理でした。

日曜日にはタンパクを回収しないといけないので、他のプロトコールを探していてAbcamのELISA sample preparation guideをみつけました。

ELISA sample preparation guide
ttp://www.abcam.co.jp/protocols/elisa-sample-preparation-guide-1

Cell/tissue extraction buffer recipe
100 mM Tris, pH 7.4
150 mM NaCl
1 mM EGTA
1 mM EDTA
1% Triton X-100
0.5% Sodium deoxycholate
Additional reagents required to produce complete extraction buffer.
Phosphatase inhibitor cocktail
Protease inhibitor cocktail
PMSF

上記がその組成ですが、これだとEGTA以外の試薬はあります。ここで質問なのですが、

１．EGTAがなくてもタンパク抽出液として機能するか？
２．もしEGTAをなしでやるとするとEDTAを２倍にしたほうがよいか？
３．EGTAの代わりになる他の試薬があるか？またその濃度は？
４．このcell extraction bufferはウェスタンブロットにも使えるか？

以上につきまして、アドバイス賜りますと幸いです。
全3件 ( 1 〜 3 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する
名前 
メール  　アドレス非公開
   タイトル 
本文      
設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます）
上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません）
解決（問題が解決した際にチェックしてください）
暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。
送信 
〔使い方〕
  • 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。
  • 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。
  • 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。