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(無題) 削除/引用 No.4260-8 - 2015/08/18 (火) 14:49:01 - こらこら クロスリンクしているコラーゲンは不溶です。グアニジン抽出後、透析すると思いますが、再び不溶しますよ。

(無題) 削除/引用 No.4260-7 - 2015/08/17 (月) 02:54:30 - 向日葵 emaさん コメントいただきありがとうございます。 クールミルというもの、初めて知りました。教えていただきありがとうございます。 P21以降だと頭蓋や肋骨でも十分量は取れそうですね。ただ胎生期18.5だと結構ロスも心配になりそうですね。。 emaさんはRIPAバッファーで調製されてるとのことですが、コラーゲン等も見られていますか？ 私の調製方法は、クールミルと同じ用途のビードビーダーで組織をRIPAバッファー中で破壊後、遠心でデブリを除いた物をウエスタンに供しています。この時、デブリといっても目に見えるほどのものは出来ていません。 ただ、こらこらさんにご指摘いただいたように、この方法ではコラーゲンが超巨大分子になっている可能性が高く上手にウエスタンで分離できていないんだろうなと思っています。 もしemaさんがコラーゲンもウエスタンで同様の方法で見ていましたら、感想を聞かせていただけますと幸いに存じます。

(無題) 削除/引用 No.4260-6 - 2015/08/17 (月) 02:39:25 - 向日葵 おおさん ありがとうございます。 グアニジン塩酸で抽出した後、ペプシンで一晩消化したものを透析するという論文も見かけました。 この方法だとクロスリンクというかポリマー化しているものを低分子にすることができるということでしょうか。 コラーゲン1ノックアウトマウスの骨組織で綺麗に野生型マウスのみバンドを出している論文があるのですが、ウエスタンの図を見る限り130−140キロダルトンにシングルバンドを示しているので、かなり均一なサンプルが調製されているようです。

ありがとうございます。 削除/引用 No.4260-5 - 2015/08/17 (月) 02:30:23 - 向日葵 こらこらさん　コメントをいただくのを諦めていたので、ここでコメントをいただけてとても嬉しく思います。 まだコラーゲン抗体は届いていないのでウエスタンの結果は分かりませんが、他のみたい細胞内タンパク質に関しては見ることができました。 こらこらさんがコラーゲン1、2を検出する際のプロトコルはどういった方法で行っているかお示し頂くことが可能でしたらお願いできませんでしょうか？ 不溶性とのこと、認識しておらず、大変お恥ずかしい次第です。

クールミル 削除/引用 No.4260-4 - 2015/08/16 (日) 16:29:19 - ema Ｐ21以降のcalvaria,Tibiaで１つ目の方法1-4でやっています。 クールミルで破砕しています。 http://www.tokken.jp/products/breaker/coolmill.html 使用前日から本体を-８０冷凍、サンプルを急いで入れて冷やしできればその日のうちに粉砕が品質が一番良かったです。 見たい分子や抗体によって効率は異なりますが、私の系では大丈夫です。

(無題) 削除/引用 No.4260-3 - 2015/08/16 (日) 14:12:13 - おお ああこれねぇ。。。 興味本位にいろいろみてみたけど、2つめやるにしてももうちょっと調査がひつようじゃないかなとおもってたんだけど。。。捨てると書いているフラクションににも蛋白が溶出していると思うし。

(無題) 削除/引用 No.4260-2 - 2015/08/16 (日) 10:33:20 - こらこら クロスリンクしているコラーゲンは不溶です。グアニジン抽出後、透析すると思いますが、再び不溶しますよ。

硬組織からのタンパク質抽出方法 削除/引用 No.4260-1 - 2015/07/11 (土) 08:02:52 - 向日葵 いつも勉強させていただいております。 mouse 胎生期18.5日目の骨組織（頭蓋骨calvariaおよび肋rib）に注目しています。 胎児からsoft tissuesを除き、残ったcalvariaおよびribよりタンパク質抽出を行い大のですが、大きく分けてプロトコールが二種類あるようです。 SDS-PAGEにて見たいものは、コラーゲンtype1, type2や細胞内タンパク質です。 どちらの方法が良いのか、経験をお持ちの方がいらっしゃいましたらご教示いただければ幸いです。 まず一つ目のプロトコルは、 1. soft tissuesを除いた骨組織の入ったチューブを液体窒素に浸ける 2. 乳鉢と乳棒を用いて粉末にする 3. RIPA bufferを加える 4. 13,000xg, 15 min遠心して、上清を回収 5. 必要ならここからTCA/acetone沈殿またはタンパク質濃度測定 二つ目のプロトコルは、 1. soft tissuesを除いた骨組織の入ったチューブを液体窒素に浸ける 2. 乳鉢と乳棒を用いて粉末にする 3. 4Mグアニジン塩酸(pH7.4)を加え、一晩ローテーションさせる 4. 遠心により生じたペレットを4Mグアニジン塩酸(pH7.4)でリンス、再び遠心（上清は捨てる） 5. ペレットを透析膜に入れ、水に対して透析を行う 6. 凍結乾燥 です。 まずE18.5のマウス組織からですので、乳鉢乳棒を使わず、できるだけロスの無い方法で抽出ができればと思っています。昔drosopholaを扱っていた時にはエッペンドルフチューブでマッシュできる棒のようなものでdrophilaからlysateを調製していましたが、今のラボにはそれがありません。 また、二つ目の方法ではどちらかというと細胞外マトリックス（コラーゲンやグリコサミノグリカン）の抽出に使っているようでしたが、ステップがかなり多く、ロスも多くあるのではとの懸念があります。 1の方法でも十分にタンパク質（コラーゲンも興味対象です）が溶出できるのであれば、それでできればと思っています。または以外の方法をとられている方がいらっしゃいましたらご教示いただけないでしょうか？ 硬組織からタンパク質抽出を行った経験がおありの方がいらっしゃいましたら、情報を共有させていただけますと幸甚です。 どうぞ宜しくお願い致します。

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