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ノックアウト細胞が死んでしまう？ トピック削除
No.4272-TOPIC - 2015/07/15 (水) 11:07:34 - 理科２
今話題のクリスパープラスミドを使ってノックアウトセルラインを作ろうとしていますが、出来てくるコロニー全てがオリジナルのものだったり、片側にのみ欠損があったり、インフレームだったりします。おそらく、ノックアウト細胞は作れないんじゃないかと思っています。

３つのセルラインで試しましたし、同じ遺伝子を標的とした異なる他２つのクリスパープラスミドでも同様でした。シークエンスしたコロニー数は２０です。ノックアウトが作れないと判断するには十分な数だと思うんです。

こういった場合、どうしたらいいでしょうか？
アールエヌアーアイを使ったノックダウンでは都合が悪いです。
困っています。手詰まりでしょうか？
　
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No.4272-6 - 2015/07/15 (水) 18:05:42 - tet
rtTA-KRAB（もしくはtTA-KRAB）を恒常的に発現させて、CRISPRで目的遺伝子の転写制御領域にTRE配列入れたらどうかな？
doxの存在でオン、オフできないだろうか。

(無題) 削除/引用
No.4272-5 - 2015/07/15 (水) 16:39:32 - おお
最初はtetでもいいのかなと私も思いましたが、たしかにリークは否定できませんね。
Creはいいアイデアと思いました。あとヘテロの株をつかって、もういっこのアレルに蛋白の安定性をコントロールできるタグをホモロガスリコンビネーションでつけれないかな。。。
なんかそんなタグが売ってたよね。薬剤で安定性がコントロールできるやつ。
あるいは、そのタグをつけて微量でもstableに発現する株を得ておいて、ゲノムの方をつぶすか。

一見インフレームで壊れてなさそうでも温度感受性があったりとかもあるので、根気がいるか、生化学的なアプローチができるならそう言う方向もありかもしれない。

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No.4272-4 - 2015/07/15 (水) 12:26:54 - 独り言
わずかな発現でも機能してしまうタンパク質なのであれば、Crisprでexon両端にLoxpを入れて、CreでKOできるようにするのがいいんじゃないかい。

(無題) 削除/引用
No.4272-3 - 2015/07/15 (水) 11:50:23 - 理科２
TK-1さん

ありがとうございます！
私も最初、テットオフのシステムでクリスパーを発現させれたらなあと思っていましたが、ノックアウトできる細胞はそのうち一部なので、上手く行かないなと思っていましたが、なるほど、目的の遺伝子をテット誘導系で過剰発現させて、それをあとでオフにするってことですね、全く思いつきませんでした。

オフといっても完全にシャットアウトしない（リーキー？）という話もチラホラ聞きます。
このタンパク質は量はめちゃくちゃ少ないみたいです。その少ない量で大事な仕事をしています。
ノックダウンを試みましたが、転写産物量は減ってるんですが、そのタンパク質の減少の表現型が見えなかったので、なんとしてもノックアウトする必要があります。リーキーだとそれでも失敗してしまうかな？とも思えますがどうなんでしょうね。

ですが、すごく斬新なアイデアをありがとうございます!!

(無題) 削除/引用
No.4272-2 - 2015/07/15 (水) 11:39:48 - TK-1
Tet-inducibleなんかで発現させた上でCRISPRでエンドをノックアウトして、そこでoffにすればいいんじゃないですか？少なくともセレクション中に消えてしまうことは避けられるかもしれません。ただ、クローニングしてoffにした後に死んでしまったらしょうがないでしょうね。

ノックアウト細胞が死んでしまう？ 削除/引用
No.4272-1 - 2015/07/15 (水) 11:07:34 - 理科２
今話題のクリスパープラスミドを使ってノックアウトセルラインを作ろうとしていますが、出来てくるコロニー全てがオリジナルのものだったり、片側にのみ欠損があったり、インフレームだったりします。おそらく、ノックアウト細胞は作れないんじゃないかと思っています。

３つのセルラインで試しましたし、同じ遺伝子を標的とした異なる他２つのクリスパープラスミドでも同様でした。シークエンスしたコロニー数は２０です。ノックアウトが作れないと判断するには十分な数だと思うんです。

こういった場合、どうしたらいいでしょうか？
アールエヌアーアイを使ったノックダウンでは都合が悪いです。
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