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(無題) 削除/引用 No.4279-10 - 2015/07/28 (火) 15:30:26 - GAPDH おおさんありがとうございます。 サンプルの輸送に関してですが、 共同研究者側で、E.18.5の出産直前のpregnantマウスを麻酔下でsacrificeし、子宮からE18.5の胎児を回収します。その後、胎児の断頭を行い血液を回収したのちに、残りの身体をPBSで湿らせたキムワイプで包み、それを50 ml tubeに入れ、fedexでovernight shippingを依頼されたものです。天候の影響を受け、48 hrsかかってしまいました。 私の手元についた時点ではサンプルはきちんと冷えていましたが。 microsomesは比較的安定なのですね。 GAPDHの低分子量のbandが現れたり、beta-actinが出ないのはおかしいですよね。 はい、ポジコンの細胞ライセートを流して、きちんとできるところまで行ってみます。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.4279-9 - 2015/07/28 (火) 14:49:46 - おお いやどの様な状態でサンプルを送っているのかわからないのでなんともいえませんけど。 たとえばmicrosomesはデタージェントなど使っていなければそんなにすぐには壊れないらしくって、何回かの凍結融解とか、4度で2、三日してからじわじわと壊れてlysateのpHが下がってくるとかいう話も聞くのでそう言う意味ではいくらか安定なのかもしれません。 まあアクチンがでないGAPDHが分解されて小さい分子量で検出されるサンプルがあるというだけで、十分相談に値すると思いますけど。アクチンがでないという信用性を担保するためにてもとの培養細胞などのcell lysateとかポジコンがあった方がいいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.4279-8 - 2015/07/28 (火) 14:17:06 - GAPDH おおさん、cbbさん 40 ugは多すぎとのことで半分、その半分と減らしてみましたが、GAPDHの発現は上昇するどころかそのまま減ってしまいました。 いくつか見たタンパク質の発現のうち、LAMP-1の発現はすべてのサンプル間で均等に発現していました。 LAMP-1はheavily glycosylated proteinsの一つなので、lysosomeの酸性プロテアーゼに対して抵抗性を持っていると拝見しました。 そこで疑問なのですが、もし私のマウス（E18.5）がfedexの配達遅延（24 hrs over）により自己融解が生じてしまっていたとしたら、GAPDHやbeta-actinは分解されてなくなってしまうが、LAMP-1はそのタンパク質の安定性から自己融解による影響を間逃れた、と解釈してもいいでしょうか？ サンプルのプロセシングは共同研究者側が行ったもので、そう簡単にもう一度サンプルのプロセシングやシッピングをお願いすることにためらいがあります。 もしこれが自己融解の可能性が高ければ、再度組織を送ってもらおうとは思っていますが...。 たとえ冷蔵配達であっても断頭済みのE18.5のマウス胎児の配達に48hrsもかかってしまったら自己融解の可能性は高いでしょうか？ > GAPDHが安定しない > けれどもLAMP-1の発現は一定 との結果から質問いたしました。

(無題) 削除/引用 No.4279-7 - 2015/07/19 (日) 08:17:11 - おお 基質の枯渇なら中抜けになるというのをよく見ますね。

(無題) 削除/引用 No.4279-6 - 2015/07/18 (土) 14:29:18 - cbb 1レーンに40 ugでハウスキーピングは多すぎな気がする。 HRP系を用いているなら濃すぎて検出する前に酵素と試薬が枯渇してるのではないでしょうか。 メンブレンに茶色のバンドが見えていたりしませんか？ 蛍光標識ならまた別問題ですけど。 ちなみに、肝臓の再生とか見る場合は、beta-actinはかなり変動するので不適切だと言われています。

(無題) 削除/引用 No.4279-5 - 2015/07/18 (土) 13:53:43 - おお 共同研究先とサンプルのプロセスのしかたをよく相談してください。

(無題) 削除/引用 No.4279-4 - 2015/07/18 (土) 13:38:53 - GAPDH おおさん、たていすさん 今日同じ組織をbeta-actin抗体でも染めてみましたが、バンドが全く出ませんでした。 サンプルは共同研究先からfedexで送られてきたマウスで、オーバーナイトデリバリーが、先の台風で一日遅れて届いたものです。 タンパク質濃度を揃えています。 あるタンパク質は全てのレーンで均等に出ますが、肝心のハウスキーピングだけはあるものはドカンと出て、あるもの（別のマウス）では全く出ません。やはり組織の壊死があり得そうですね。beta- actinですらでませんので。。困りました。

(無題) 削除/引用 No.4279-3 - 2015/07/18 (土) 11:05:41 - たていす 曲者なのは、肝臓のGAPDHではなく、あなたの使っているGAPDH抗体の可能性はないのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.4279-2 - 2015/07/17 (金) 18:03:30 - おお 動くかどうかは見ている現象などにもよるでしょうから、あなたの実験で相応しいものを見つけるしかないでしょうけど。25kDaに出るのはさすがにちょっとどうかなっておもいますが、、、組織がすでに壊死しているとかないでしょうか。 肝再生の分野であれは動くとかいう話もあったので(どれだったか思い出せませんけど)調査などもした方がよさそうです。

GAPDHが出たりでなかったり・・ 削除/引用 No.4279-1 - 2015/07/17 (金) 16:19:42 - GAPDH マウスの組織をwesternしてるんですが、その際、ハウスキーピングタンパク質としてGAPDHを見ています。組織は肝臓なんですが、マウスは全て野生型にも関わらず40 ugを一レーンに流しても35 kDaにbandがガツンと出るものもあれば、25 kDa付近に出てしまうもの、全く何もでないものがあります。腸管をやってる同僚もカンファで似たようなことを言っていたりします。 GAPDHよりはbeta-actinとか他のハウスキーピングタンパク質の方がいいでしょうか？ GAPDHはクセ者というかブレがあるような気がします。

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