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H1 promoter, U6 promoter によるRNA発現の確認 トピック削除
No.4284-TOPIC - 2015/07/21 (火) 02:14:30 - H2
お世話になっております。

現在H1プロモーターを持つプラスミドに300bp程度のインサートを組み込みHek293細胞に発現させております。この300bほどのRNA発現を確認するために、トランスフェクションしたHek293細胞をTrizolで回収後、specific primerを用いてRT-PCRを行っています。
ですが目的のバンドが全く出てきません。RT-PCR産物をNested PCRにもかけてみましたが、まったくバンドが見えず困っております。
またspecific primerをコンジュゲートした磁性ビーズとLysis bufferで溶かした細胞抽出液を混ぜ、RNAの単離を行い、同様のRT-PCR,NESTED PCRを行いましたが何も見えてきませんでした。(単離操作はNEBのRNA単離プロトコルに従っています)

H1プロモーターを持つプラスミドは初めて使いましたが、発現が弱いものなのでしょうか?
または300bpのインサートが大きすぎるのかもしれませんが。
あるいは発現するRNAはポリAを持ちませんので不安定なのかなとも思っております。

インサート配列の確認は行っており、transcription initiation site, end siteの確認はできております。

U6プロモーターを持つプラスミドでも試してみようと考えております。
どなたかアドバイスを下さると大変助かります。
宜しくお願い致します。
 
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(無題) 削除/引用
No.4284-12 - 2015/07/21 (火) 22:04:44 - H2
なるほどステムループは構造的にRNAse耐性になりそうですね。
私が今発現させているKanRはそのような構造を持っておりませんし、すぐに分解されている可能性がありますね。
実際にH1,U6の下流にある遺伝子をインサートとして過剰発現させたほうが良さそうですね。

またHiston RNAに関しての論文ありがとうございました。
実はHiston RNAも実験に使っておりまして、キャップがつかないものと認識しておりました。
これに関して実験がうまくいかない理由が分かった気がします。
有難うございます。

(無題) 削除/引用
No.4284-11 - 2015/07/21 (火) 21:43:18 - おお
ん、H1はわたしが違うものと勘違いしてたかな。失礼しました。U6snRNAはちょと見たところ配列依存性みたいなので、それがないとつかないかな。

capやpolyAがつかないとなると安定性をほかのメカニズムで担保しないといけないので、どうでしょう。それが原因でRTPCRがかからないんでしょうか。ステムループなどつくり構造的にRNase耐性にしたりとかあるようなので。

(無題) 削除/引用
No.4284-10 - 2015/07/21 (火) 17:42:13 - H2
おお様、

h1もu6もキャップがつくんですね。勘違いをしておりました。
ただいくつかの論文に以下のような記述が見受けられます。
Biochimie
RNAi in mice:
a promising approach to decipher gene functions in vivo

Indeed, several laboratories have developed
new plasmids containing polymerase III promoters, like the
ones of the U6 and H1 genes, known to synthesize small
RNA. Those vectors allow synthesis of 50 bp-long singlestrand
RNA that folded in 21–23 bp dsRNA with a small hairpin
in the middle. These shRNAs lack a 5′ cap and a long
polyadenylated tail [31–33]

BBRC
Simple and efficient DNA vector-based RNAi systems
in mammalian cells

RNA Pol III promoters, especially
H1 and U6 from human and mouse, have been used
most frequently, since they have a well-defined start site
of transcription and a simple effective termination signal
consisting of only five or six consecutive thymidine residues
(Ts), and therefore they are suitable for the synthesis
of small RNA transcripts. Moreover, they can
efficiently transcribe small RNA transcripts lacking both
the 50 cap and 30 polyadenosine [poly(A)] tail [32,33].

ただこれらの引用論文をみてもキャップ構造に関しての記述がございません。
彼らは適当に書いていたのでしょうか。。。

(無題) 削除/引用
No.4284-9 - 2015/07/21 (火) 13:48:13 - おお
Histone H1はcapついたと思いますが、そのあとのプロプロセッシングではずれることを期待しているのでしょうか。

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2715827/
Like polyadenylated mRNAs, metazoan canonical histone mRNAs have a 7-methyl-guanosine cap at the 5′ end. However, unlike polyadenylated mRNAs, histone mRNAs end in a stem–loop,

U6もCAPつきますよね。

何か勘違いしていたらごめんなさい。

(無題) 削除/引用
No.4284-8 - 2015/07/21 (火) 12:48:30 - H2
おお様、

有難うございます。
コンストラクトはshRNA発現用のプラスミドです。
そしてインサートは、奇妙に思われると思いますが、Kanamycin Resistance geneから300bpとり入れています。5’キャップがつかないRNAを発現させたく、身近にあったこの配列を入れてみました。(KanRのCDSの中間あたりの配列をとりました)。インサートの調製はshRNAの調製と同様にH1promoterの転写開始に必要なAAを5’に加え、転写終結に必要なTTTTTを加えました。300bpのなかにはTTTTTは含まれておりません。
shRNAが発現するのならこのインサートでも発現しそうなのですが。

(無題) 削除/引用
No.4284-7 - 2015/07/21 (火) 11:15:13 - おお
>[Re:4] H2さんは書きました :
> おお様、
>

>
> RTに用いるReverseプライマーを150bp程度のところに設定したのですが、中間地点あたりだと結合しにくいとかはあるのでしょうか。


一般的にはないです。

Histone H1などはpolyAがつかず、U7snRNPの助けで3'endがきまります。要するに、あなたの遺伝子の末端のプロセッシングがどうなっているのか、あなたの遺伝子の3'endプロセッシングが機能してない場合はベクター側に何かそう言ったものがついているのかが気になるわけで、そう言う意味でconstructionを見ないと何ともいえないと思ったわけです。

(無題) 削除/引用
No.4284-6 - 2015/07/21 (火) 11:10:41 - H2
seventh様、有難うございます。
はい、RT-PCRはワンステップのキットを使っております。
なるほどRTのみをやると上手く行くこともあるのですね。
ランダムプライマーも試してみます。
ご助言有難うございます。

(無題) 削除/引用
No.4284-5 - 2015/07/21 (火) 10:48:21 - seventh
RT-PCRはワンステップですか?
ワンステップでうまくいかないようなら個別の系で試してみたほうが良いかもしれないです。
RT時のプライマーもランダムプライマーにしてみるとか

(無題) 削除/引用
No.4284-4 - 2015/07/21 (火) 06:15:00 - H2
おお様、

ご回答有難うございます。
大変参考になります。
プライマーはPrimer BLASTでTm60のものを作りまして、この実験以外では使っておりません。ワークしていない可能性もあります。
プラスミドとプライマーでPCRをかけてみて増幅するかどうかを確かめてみます。
プロセッシングされるサイトは無いはずですが調べてみます。
H1とU6は強力なプロモーターですか。。。
何かおかしなことを私がやっていそうですね。

RTに用いるReverseプライマーを150bp程度のところに設定したのですが、中間地点あたりだと結合しにくいとかはあるのでしょうか。あるいはTm60ですとRTに用いるにはTmが高すぎるとか。初歩的な質問で申し訳ございません。

(無題) 削除/引用
No.4284-3 - 2015/07/21 (火) 06:01:22 - おお
H1 promoter, U6 promoter は一般的に強力なプロモーターといわれているとおもいます。

(無題) 削除/引用
No.4284-2 - 2015/07/21 (火) 05:09:26 - おお
H1のmRNAは2kbぐらいじゃなかったかな。そう言う観点からだと300は大きくないと思うけど。RNAがあるならワークする系でRTPCRがかからない理由はないとおもうので、どこか実験系がまずいのかと。スペシフィックプライまーがうまく働いてないとか。PCRのプライまーはworkすることを確認してますか?
あとはRNAの扱いとか、、、
constructionを見てみないとわからないですが、300弱のものを入れて発現させたことはありますので、、、

プロセッシングされている可能性はないのですか?

Nested PCRとかするとプラスミドからのシグナルとか拾ってきそうなんですが、それもないのですよね、、、

H1 promoter, U6 promoter によるRNA発現の確認 削除/引用
No.4284-1 - 2015/07/21 (火) 02:14:30 - H2
お世話になっております。

現在H1プロモーターを持つプラスミドに300bp程度のインサートを組み込みHek293細胞に発現させております。この300bほどのRNA発現を確認するために、トランスフェクションしたHek293細胞をTrizolで回収後、specific primerを用いてRT-PCRを行っています。
ですが目的のバンドが全く出てきません。RT-PCR産物をNested PCRにもかけてみましたが、まったくバンドが見えず困っております。
またspecific primerをコンジュゲートした磁性ビーズとLysis bufferで溶かした細胞抽出液を混ぜ、RNAの単離を行い、同様のRT-PCR,NESTED PCRを行いましたが何も見えてきませんでした。(単離操作はNEBのRNA単離プロトコルに従っています)

H1プロモーターを持つプラスミドは初めて使いましたが、発現が弱いものなのでしょうか?
または300bpのインサートが大きすぎるのかもしれませんが。
あるいは発現するRNAはポリAを持ちませんので不安定なのかなとも思っております。

インサート配列の確認は行っており、transcription initiation site, end siteの確認はできております。

U6プロモーターを持つプラスミドでも試してみようと考えております。
どなたかアドバイスを下さると大変助かります。
宜しくお願い致します。

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