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(無題) 削除/引用 No.429-4 - 2012/04/19 (木) 16:33:31 - ninnin 早速のご回答ありがとうございます。 ＞中年さん 酵素はBAL31 Nucleaseを使用しています。消化条件は以下の通りです。 ・DNA:2μg ・2×Buffer:25μl ・BAL31:1U ・H2O:Up to 50μl これを30℃で反応させました。 ＞monさん リンカー配列の再検討行ってみます。PCRの条件につきましては、論文に記載されていた方法をまねてあり、アニーリング後の伸長反応時間が10分と非常に長いです。もともと長めの領域を増幅したかったということがありましてこのような反応時間となっています。それでもエキソ消化後でしたのである程度鎖長に差が出ると思っていたのですが・・・やはり再検討が必要ですね。貴重なご意見ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.429-3 - 2012/04/18 (水) 19:42:30 - 中年 エキソヌクレアーゼ消化とありますが、酵素は何を使ってどのように反応していますか。

(無題) 削除/引用 No.429-2 - 2012/04/18 (水) 19:05:35 - mon エキソ消化を0分でも長鎖DNA？が増幅するなら、リンカー配列が不適切かPCR反応条件が不適切ではないでしょうか？

エキソヌクレアーゼ消化後のライゲーションとPCR 削除/引用 No.429-1 - 2012/04/18 (水) 18:29:47 - ninnin はじめまして。よろしくお願いいたします。 エキソヌクレアーゼで直鎖DNAを消化した後のライゲーションとPCRについて伺いたいことがあり書き込みさせていただきました。 私は現在DNAのエキソ消化を0、10、20、40、60分の五段階の時間で行った後、リンカーをライゲーションさせてPCR増幅を行うという実験をしています。しかしながらPCR後のサンプルを電気泳動した際、すべて消化時間にかかわらずかなり長鎖の産物(20kb以上)ができてしまい、泳動距離に全く差が見られませんでした（本来は消化時間に応じて泳動距離に差が出る予定でした）。DNAの消化自体は上手くできているようで、DNA量を測定した時は時間に応じて減少していました。 このような場合、長鎖のDNAができてしまう原因としてはどのような物が考えられるでしょうか？消化後やライゲーション後にDNAの精製作業を加えたり、リンカーの濃度などを調節しても変わりませんでした。どなたか同じような経験をされた方いらっしゃいましたらよろしくお願いいたします。 ちなみにライゲーションにはTaKaRa DNA Ligation Kit Ver.2.1、PCRにはTaKaRa LA Taq Hot Start Versionを使用しています。PCRの際のテンプレートの量は2.5ng、PCRのサイクル数は30サイクルです。

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