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(無題) 削除/引用 No.4290-8 - 2015/07/23 (木) 20:42:18 - りえ 独り言さん、わざわざご丁寧にありがとうございました。 大変参考になり、喜んでおります。 今後とも宜しくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.4290-7 - 2015/07/23 (木) 19:40:36 - 独り言 > 制限酵素サイトの関係で、プロモーターとEGFPのATGの間に、100bpほどの > 意味のない配列が含まれるのですが、このような無駄な配列が長いと > EGFPの発現に影響がでてしまうものでしょうか？ 100bpが影響するかもしれないし、影響しないかもしれないし、その配列が何に由来するのかわからないのでなんともいえない。また関係ないと思われても、100％関係しないと言い切れない。実際に使ってみたデータでもない限りは。 私なら、EGFPのN末と下流の目的タンパク質のC末に全長を増幅されるPCR用のプライマーを設計して、さらにそのプライマーの外側に適当な制限酵素を付加しておき、PCR後、その制限酵素で切って、目的ベクターにつなげます。これならEGFP-目的遺伝子の前後にどんな制限酵素サイトでも加えられます。 例えば下記のサイトの http://www.promega.co.jp/jp/jp_tech/FAQs/Q&A_FlexiVector.html 「Flexi® Vector Systemの使用方法を簡単に説明してください。」 という項目を参考にしてみてください。一般的な方法なので、どんなベクターにもで使えます。

(無題) 削除/引用 No.4290-6 - 2015/07/23 (木) 18:36:24 - りえ すみません、N末にタグをつけるのでコザックはつけないと考えました。 独り言さん、色々とありがとうございます。 それと、これとは別の質問になってしまい申し訳ないのですが、 もう一つ質問させて下さい。 EGFPの上流に、ある遺伝子のプロモーターを挿入したレポーターベクターを 作製する予定です。 制限酵素サイトの関係で、プロモーターとEGFPのATGの間に、100bpほどの 意味のない配列が含まれるのですが、このような無駄な配列が長いと EGFPの発現に影響がでてしまうものでしょうか？ もし影響がでるのでしたら、どれほどの長さの無駄な配列に減らせば よいのでしょうか？ 周りに詳しい者がいないので、ここで質問させてください。

(無題) 削除/引用 No.4290-5 - 2015/07/23 (木) 18:11:42 - 独り言 タグをつけないのであれば、N末にコザック配列を入れておかないと翻訳効率が悪くなってしまいます。 開始ATGのまえにA/GCCとATGの後ろにGがつく配列です。すでにmRNAに入っていれば一緒にクローニングすればいいですが、入っていない遺伝子であれば、入れたほうが無難です。 https://ja.wikipedia.org/wiki/%E3%82%B3%E3%82%B6%E3%83%83%E3%82%AF%E9%85%8D%E5%88%97 例えば開始ATGの回りをaccATGgとするのです。

(無題) 削除/引用 No.4290-4 - 2015/07/23 (木) 16:00:50 - りえ アドバイスをありがとうございます。 mRNA上のアミノ酸配列のみと聞いて安心しました。 また、mRNA上にストップコドンもみつけました（うっかりでごめんなさい）。 すみません、N末のコザックの意味がよくわかりませんでした。 発現させるcDNAはマウス由来で、コザックはつけない方向で 考えておりました。

(無題) 削除/引用 No.4290-3 - 2015/07/23 (木) 15:40:38 - 独り言 タンパク質を発現させることが目的であれば、アミノ酸配列のみベクターに入れれば大丈夫です。 ただし、N末のコザックには気をつけてください。どの生物か、N末にタグあるのかわかりませんが。 最後のリジンの後ろにストップコドンがｍRNA上に入っていませんか？

(無題) 削除/引用 No.4290-2 - 2015/07/23 (木) 14:18:13 - りえ 質問の追加です。 この遺伝子の最後のアミノ酸がリシンで終わってるのですが、 最後にストップコドンを付けた方がよいのでしょうか？

発現ベクターに挿入するcDNAについて 削除/引用 No.4290-1 - 2015/07/23 (木) 14:14:13 - りえ 初歩的な質問でごめんなさい。 ある遺伝子の発現ベクターをつくるため、その遺伝子のmRNAの配列を NCBIのサイトから検索していました。 また、その遺伝子のアミノ酸配列を調べると、mRNAの配列の一部に 相当していました。 この場合、PCRで増幅させる配列は、アミノ酸配列をコードする一部の mRNAの配列で大丈夫なのでしょうか？

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