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(無題) 削除/引用 No.4311-13 - 2015/08/09 (日) 18:02:26 - asan 293とかだと、ステーブル細胞で24-48時間培養すると過剰発現タンパクはかなり出てるので、普通に培地を一部回収して濃縮なしでウエスタンするだけでもディテクトできたりしますよ。もちろんFCSが入ってるとウエスタンに邪魔なのでFCSフリーで培養しておきますが。 GFPタンパクを回収するキットもあるみたいですけど、よくやられるのはhisとかflagなんかをつけておいてNi-NTAビーズとか有名なM2ビーズなんかで上清からIPすれば結構濃縮できるんじゃないかと思います。imidasolとかFlag peptides溶出できますしね。imidazolで回収するなら大量にやればタンパク量も定量的に議論できるかもしれませんしね。ライセートの場合は、タンパクのプロセシングの問題もですけど、コンタミも増えるのでhisは向かないかもしれませんけど、上清の場合は結構相性がいいです。 GFPが必要な場合でもGFP-His6とかのコンストラクトをあえて作ってやるとかでいいのかなとは思います。

細胞からGFP fusion タンパクの回収方法 削除/引用 No.4311-12 - 2015/08/03 (月) 14:41:18 - んやち 独り言様 詳細情報誠にありがとうございます！ 深謝致します。 無血清培地で実施致しようと思います。

細胞からGFP fusion タンパクの回収方法 削除/引用 No.4311-11 - 2015/08/03 (月) 14:38:10 - んやち gg様 御指摘ありがとうございます。 軟骨の研究でATDC5細胞を用いて今回の実験以外にも他の研究をしており、その絡みでATDC５細胞を使用しておりました。 しかし、ご指摘のとおり293やCHO細胞を使用することも検討しようと思います。 アドバイス誠にありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.4311-10 - 2015/08/03 (月) 12:08:01 - 独り言 > > 確かに機能しないタンパクを見ても意味がないですね。 > 限外濾過で濃縮さっそくためしてみます。 > 簡単、安価で最高です。 > ご丁寧にお答えいただき誠にありがとうございました！ ちなみに10%FBSの培地だとタンパク質がありすぎて10倍ぐらいまでしか限外ろ過できないので、分泌させている期間を1%FBS、できれば無血清で培養して培養上清を回収できればベストです。

(無題) 削除/引用 No.4311-9 - 2015/08/03 (月) 11:59:31 - gg ひとつ不思議に思うのは、組換えタンパク質を発現するためになぜATDC5細胞を用いるか、ということです。 大量に目的のタンパク質が欲しいのであれば、293細胞やCHO細胞などを用いた方がレンチウイルスを使う必要もないし、大量培養の方法も確立されています。 ATDC5細胞でなければいけない理由があるのでしょうか？ 培養上清からの精製で抗体カラムを用いる場合、溶出方法によっては目的のタンパク質の活性に影響がでる可能性があることを注意する必要があります。

細胞からGFP fusion タンパクの回収方法 削除/引用 No.4311-8 - 2015/08/03 (月) 11:48:15 - んやち おお様 なるほど。細胞内ではプロセッシングが完了していないものもありますよね。 ありがとうございます！ AP様 このようなものがあるのですね。 具体的なキットや参考のサイトをお教え頂き誠にありがとうございます！ 参考にさせていただきます。 独り言様 確かに機能しないタンパクを見ても意味がないですね。 限外濾過で濃縮さっそくためしてみます。 簡単、安価で最高です。 ご丁寧にお答えいただき誠にありがとうございました！

(無題) 削除/引用 No.4311-7 - 2015/08/03 (月) 11:14:16 - 独り言 他の方もコメントありますが、細胞内は完全な成熟型とは限らないので、普通はやらないと思います。量がとれても機能しないものが取れてもいみがないのでは。 培地から精製するのが面倒であれば、とりあえず、培養上清をそのまま目的細胞にふりかければいいと思う。（その因子が通常のFBSに含まれていないのであれば、これで十分）。精製でなくとも培養上清を限外ろ過で濃縮すれば、濃い濃度で使えますし。なにより簡単。

(無題) 削除/引用 No.4311-6 - 2015/08/03 (月) 10:59:37 - AP 抗GFP抗体を用いた免疫精製用の製品も出回っているし http://www.miltenyibiotec.co.jp/ja-jp/products-and-services/macsmolecular/protein-research/epitope-tagged-protein-isolation-and-detection/macs-and-multimacs-gfp-isolation-kits.aspx http://www.funakoshi.co.jp/contents/3711 gfp-tag protein purificationとでも検索するとかなりの文献があると思うが。

(無題) 削除/引用 No.4311-5 - 2015/08/03 (月) 10:59:18 - おお 細胞内のものはプロセッシングが完成してなかったりする可能性もあるかと思いますし。。。

(無題) 削除/引用 No.4311-4 - 2015/08/03 (月) 10:57:04 - おお 培養した培地を目的の細胞にかけるだけでいいのでは?

細胞からGFP fusion タンパクの回収方法 削除/引用 No.4311-3 - 2015/08/03 (月) 10:44:06 - んやち gg様 書き込み誠にありがとうございます。 おっしゃるとおり培地の回収も考えているのですが、培地からの良い回収法などご存知でしょうか。 また、培地からだと回収量が少ないと思いまして細胞を破砕して回収する方法も検討しております。（分泌タンパクですがGFPが付いているので、細胞質のものも回収して観察する分にはよいかなと思いました） お手数ですが、アドバイス頂けたら幸いです。

(無題) 削除/引用 No.4311-2 - 2015/08/03 (月) 10:33:54 - gg 分泌タンパク質なら、培地を回収するべきでは？

細胞からGFP fusion タンパクの回収方法 削除/引用 No.4311-1 - 2015/08/03 (月) 10:30:36 - んやち こんにちは。 ある分泌タンパクの細胞内での局在を調べるためにマウスの軟骨系cell lineであるATDC5細胞にレンチウィルスでその分泌タンパクのGFP fusion 分泌タンパクを作らせています。そのATDC５細胞を破砕してGFP fusion 分泌タンパクを抽出し、他の細胞にかけてGFPを観察することにより細胞内の分泌タンパクの局在を知りたいと思っています。 GFP fusion 分泌タンパクを作らせたcell lineからうまく抽出する方法をどなたかご存知でしょうか。 お手数をお掛けしますがお教え頂けたら幸いです。 何卒よろしくお願い申し上げます。

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