Bio Technical フォーラム

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dye in PCR mix トピック削除
No.4313-TOPIC - 2015/08/03 (月) 14:00:59 - おお
アガロースなどで電気えいどうするときに使うBPBなどですが、PCR mixにグリセロールなどとともに加えておくと、PCRが終わったときそのまま電気えいどうできるんじゃないかなと思って調べたところTOYOBOがBPBがあらかじめ入ったmixを売ってたのをみました。
BPBを入れることにはPCRのじゃまをするかどうかということであまり気が進まなかったのですが、商品化されているならとおもってBPBをまぜたところ(通常の6xdyeとかじゃないのでEDTAとか余分なものははいってません)、なんかかかりません。。。
ちょっとまだBPBが悪さしていると結論づけるためのside by sideのPCRをしてませんので言い切れないのですが、どなたかBPBのPCR阻害などに関してご存じの方、使ったご経験のある方いらっしゃいませんでしょうか?

プロメガなどほかの会社はちがうdyeを使ってたりするようで、そういうdyeをワザワザ買うのもどうかなとおもったので今回BPBを使ったんですが、、、
　
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No.4313-7 - 2015/08/04 (火) 22:03:55 - おお
ありがとうございました。でいまのところ作ったglycerol溶液を10倍にDMSOとBSA溶液で希釈してpHをもう少し持ち上げてみました。これでPCRはかかるようになりましたが、Dyeがちょっと薄すぎるのでもとのglyserol溶液をもうちょっと加えて5倍希釈程度になるようにしてというところで、やっている実験は一区切りついてしまったので、、、

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No.4313-6 - 2015/08/04 (火) 16:34:10 - ：
もう少しグリセロール濃度を落としています。
経験上、プライマーによってきちんと増える時と増えない時があります。

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No.4313-5 - 2015/08/03 (月) 23:28:02 - おお
80%のグリセロールに溶かして、かなり酸性に偏っているのでNaOHでちょっと持ち上げて(1-2mMぐらい加えたことになっているはず)、それを20xとして使ってます。色は緑がかった暗い色で緑から青に変わりかけたぐらいという感じで、ここまであげておいたらまずは大丈夫かなと思ったのですが、、、今調べるとまだちょっと低いかもしれませんね(pH 4と5の間くらいなので)。20xでPCR bufferのbuffer効果もあるのでそれでなんとかなるかとおもっていましたが、、、実際にdyeを加えると、しっかりした青になりますけど。酵素はほぼ最後に入れますので、dyeを入れたときの影響はないはずで、、、

特許の条件ではBSAなども入っているので蛋白への親和性をある程度吸収できるようになってるのかもとも思い始めています。実際に蛋白に親和性があるような色素もリストの中にあったりしますから。あとはよわいdetergentを使うとか、、、

でも試行錯誤がいろいろ必要ならちょっとめんどくさいですね。

(無題) 削除/引用
No.4313-4 - 2015/08/03 (月) 22:07:04 - AP
濃度なんかにもよるという思うんですが。
それとBPBはそれ自体かなり酸性なので、最終的にバッファされると言っても、入れた瞬間に悪さをする可能性があります(DNAなんかそれで変性して移動度がおかしくなることもある)。あらかじめ適当なバッファでストック溶液にしてから加えたりしてます？

(無題) 削除/引用
No.4313-3 - 2015/08/03 (月) 21:31:59 - おお
ありがとうございました。最初のやつはBPBが入ってるんでしょうかねぇ。。。

特許の方ではBPBもリストに上がってますね。

とすると、BPBのpurityなど副産物の問題か、PCRがワークしてないだけか、、、まいったなぁ。side by sideでできればほかのdyeも試してみることにします。

(無題) 削除/引用
No.4313-2 - 2015/08/03 (月) 15:12:15 - ま
ttp://www.rizo.co.jp/PCRS.html
こんなのもあるみたいなのでBPB自体はTaqを阻害する感じじゃない気がします。

ttp://www.kenkyuu2.net/cgi-biotech2012/biotechforum.cgi?mode=view;Code=3943
リンク先の特許（？）までは読んでないですが阻害されないらしいとコメントがありますね

dye in PCR mix 削除/引用
No.4313-1 - 2015/08/03 (月) 14:00:59 - おお
アガロースなどで電気えいどうするときに使うBPBなどですが、PCR mixにグリセロールなどとともに加えておくと、PCRが終わったときそのまま電気えいどうできるんじゃないかなと思って調べたところTOYOBOがBPBがあらかじめ入ったmixを売ってたのをみました。
BPBを入れることにはPCRのじゃまをするかどうかということであまり気が進まなかったのですが、商品化されているならとおもってBPBをまぜたところ(通常の6xdyeとかじゃないのでEDTAとか余分なものははいってません)、なんかかかりません。。。
ちょっとまだBPBが悪さしていると結論づけるためのside by sideのPCRをしてませんので言い切れないのですが、どなたかBPBのPCR阻害などに関してご存じの方、使ったご経験のある方いらっしゃいませんでしょうか?

プロメガなどほかの会社はちがうdyeを使ってたりするようで、そういうdyeをワザワザ買うのもどうかなとおもったので今回BPBを使ったんですが、、、
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