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(無題) 削除/引用 No.4327-8 - 2015/08/10 (月) 01:59:53 - 膜フラ おお様、再びコメントをいただきありがとうございます。 > まあ比較するサンプルで同じようにやって得られたフラクションを、蛋白定量して一定量流せばそれでいいはずですが、アクチンなどでinternal controlが示せないので、流した総蛋白を染めたりして示した方がいいかもしれません。 膜フラクションを回収した場合のloading controlに関してもどうしたらよいのか悩んでいたところでした。やはりポンソー染色かCBBでやるほかなさそうですね。 > もう一つ検出する方法は細胞のtotal lysateをとってきてIPで濃縮して流す方法です。おなじ抗体でIPとWBをやってもいいです。ただし抗体の位置に近ければ検出に工夫が必要でしょうけど。lysateの蛋白量をあわせてIPすれば理屈では同じ細胞数から取れる蛋白量を見ているといえるわけです。ただ定量について絶対的な方法ではないと思っている人もいるかと思います。IPできる抗体であれば、あるいはIPできる抗体があれば一度考えてみてください。 IPに関しては考えたこともありませんでした。 一度293Tで過剰発現させてみて、total cell lysateからIP可能かどうかを確認してみます。 新しい気づきを与えてくださりありがとうございます！！ それにしてもwesternで検出が困難なものばかり対象にしています・・

(無題) 削除/引用 No.4327-7 - 2015/08/09 (日) 15:46:45 - おお やはり(半)定量がからんできますか、、、 フラクションをわけると量の比較という意味でだんだん難しくなるというか、本当のところどうなんだろうという部分が増えてきます。 まあ比較するサンプルで同じようにやって得られたフラクションを、蛋白定量して一定量流せばそれでいいはずですが、アクチンなどでinternal controlが示せないので、流した総蛋白を染めたりして示した方がいいかもしれません。 もう一つ検出する方法は細胞のtotal lysateをとってきてIPで濃縮して流す方法です。おなじ抗体でIPとWBをやってもいいです。ただし抗体の位置に近ければ検出に工夫が必要でしょうけど。lysateの蛋白量をあわせてIPすれば理屈では同じ細胞数から取れる蛋白量を見ているといえるわけです。ただ定量について絶対的な方法ではないと思っている人もいるかと思います。IPできる抗体であれば、あるいはIPできる抗体があれば一度考えてみてください。

(無題) 削除/引用 No.4327-6 - 2015/08/09 (日) 15:14:39 - 膜フラ おお様 重ねてお礼申し上げます。ありがとうございます。 > 核がその構造を残しているならけっこうなボリュームになると思いますよ。ゴルジって核にくっついて取れてくる可能性はあるんでしょうか。その点については詳しくはわかりません。誰か知っている人のコメントがあるといいですけど。 > > 超音波以外にはたとえばニードル25Gぐらいに細胞けんだく後シリンジで10回ぜんご通してやって壊すというのもあります。これも核はほぼインタクトです。 > またグラスビーズをいれてボルテックスで混ぜて壊すっているのもあります。これはかくも損傷するでしょう。核膜近傍でアソシエーションがあるならてかもしれません。 > いろいろな方法をご教示いただきありがとうございます。 私の興味は両親とその子（患者）でのあるタンパク質の量を定量化することです。 患者ではそのタンパク質は増加しているはずです。ですが、その量は極めて少なく、できるだけbiasのかからない少ないステップでのタンパク質抽出を目指しています。 そういった理由から膜画分を取るためにシリンジでやるよりかは全サンプルを同時に均一に処理できる全自動sonicationを用いました。他のlabからの借り物で、非常に重宝しているものです。できれば、これで行えれば・・と思っています。 > あ、了解です。確かにちょっとオーバーロードはきになってました。Tritonで回収した膜を可溶化するのは私はありだとおもいます。もう少し強いlysis bufferだとRIPA bufferとかありますtriton x-100かNP-40 1%ぐらいにdeoxycholate 0.1-1%とSDS 0.1%がはいってます(場合によってはSDSが入ってなかったりdeoxycholateのかわりにCHAPSが使われたりします)。 > > 一応不溶なものを回収して、効率よく溶出できているかなど確認するとよいかと思います。 おお様にコメントいただくことができて、とても安心できました。 そうですね、おっしゃるように、一応Triton X-100に溶けなかったものもSDS-PAGEすべきですね。相談させていただき、本当によかったです。 休日にもかかわらず、ありがとうございました！

(無題) 削除/引用 No.4327-5 - 2015/08/09 (日) 13:48:31 - おお >[Re:4] 膜フラさんは書きました : > おお様 > > 実は5secx2の超音波処理後の500xgの遠心で結構ガッツリとしたペレットができるんですよね。超音波を当てる前と変わらないほど・・ここにゴルジが含まれていないといいのですが。。もう少しsonicationをしたほうがいいでしょうか・・ 核がその構造を残しているならけっこうなボリュームになると思いますよ。ゴルジって核にくっついて取れてくる可能性はあるんでしょうか。その点については詳しくはわかりません。誰か知っている人のコメントがあるといいですけど。 超音波以外にはたとえばニードル25Gぐらいに細胞けんだく後シリンジで10回ぜんご通してやって壊すというのもあります。これも核はほぼインタクトです。 またグラスビーズをいれてボルテックスで混ぜて壊すっているのもあります。これはかくも損傷するでしょう。核膜近傍でアソシエーションがあるならてかもしれません。 > ここでは膜分画を超遠心したのちに1% Tritonを加えているのでtotal cell lysateというよりは、1% Triton X-100に可溶性な '膜' タンパク質が抽出されてくると考えています。...、結局SDS-PAGEをした時にオーバーロードになったり あ、了解です。確かにちょっとオーバーロードはきになってました。Tritonで回収した膜を可溶化するのは私はありだとおもいます。もう少し強いlysis bufferだとRIPA bufferとかありますtriton x-100かNP-40 1%ぐらいにdeoxycholate 0.1-1%とSDS 0.1%がはいってます(場合によってはSDSが入ってなかったりdeoxycholateのかわりにCHAPSが使われたりします)。 一応不溶なものを回収して、効率よく溶出できているかなど確認するとよいかと思います。

(無題) 削除/引用 No.4327-4 - 2015/08/09 (日) 13:11:43 - 膜フラ おお様 コメントいただきありがとうございます。 > この段階で細胞が壊れているかが一つのポイントだと思います。 この超音波処理5secx2は事前に条件検討で定めたものです。 5secごとに超音波処理し、トリパンブルーで染色しています。 この5secx2の処理ではすべての細胞が青く染まります。 ただ、30secもやるとトリパンブルーで染めてもすべて跡形もなくなって青い断片すら見えません。そこで、5secx2ですべての細胞が染まる=細胞膜が損傷を受けていると判断して、これにしました。 > >核やデブリ除去の目的で500xg, 10 min, 4度で遠心 > > 核やデブリはこれで除けているでしょうけど、6000-8000g位でまわすとミトコンドリアや細胞の大きめの構造物が除けると思います。 実は5secx2の超音波処理後の500xgの遠心で結構ガッツリとしたペレットができるんですよね。超音波を当てる前と変わらないほど・・ここにゴルジが含まれていないといいのですが。。もう少しsonicationをしたほうがいいでしょうか・・ > 不溶性物質にものがこないなら遠心して除く手もあると思います。超音波以外で溶かしたいなら室温で飽和した尿素を等量加えてるというのもありかと思います。尿素はchaotropic な作用があるのでかなりのものがとけるとおもいます。ただし尿素を加えた後はボイルしない方がいいです。また100-300mMのNaClにしてやるとある種の蛋白は溶出しやすくなると思います。 > > 不溶性にほとんどものがくるなら、不溶なものを回収して尿素で溶かす手もあります。 > > 今考えていることとして、1% Triton X-100ベースのregularなlysis bufferの200 ul程度を膜分画ペレットに加え、よくピペッティングしたのち、不溶性のものは500xg, 5 min程度の遠心で除き、上清に6x SDS sample bufferを加えてボイルをしようかと思っています。つまり、Triton-X100で目的のゴルジ局在タンパク質が膜から溶けでてくることが前提でのプロトコルです。 > > たいていその方法で取れてくるサンプルをtotal lysateとよびます。100%とは言い難いですが膜タンパク質を含めてたいていのものが抽出されるという風に思われているようです。第一選択といってもいい方法ですが、ターゲットが微量であれば検出が難しくなります。 ここでは膜分画を超遠心したのちに1% Tritonを加えているのでtotal cell lysateというよりは、1% Triton X-100に可溶性な '膜' タンパク質が抽出されてくると考えています。これまで強めにパックされた膜分画に少量のSDSサンプルバッファーを加えているので、結構乱暴なことをしているなあという気はしていました。尿素を加えるという方法をご教示いただきありがとうございます。ただ、尿素の場合にも膜分画のペレットを強く溶かすため、結局SDS-PAGEをした時にオーバーロードになったり膜タンパク質以外のもの（？）のキャリーオーバーがあってwesternでは検出できなくなっているんではとの危惧があります。 > 293Tをつかってどのフラクションに目的の蛋白がくるのか探ればいいんじゃないでしょうか? 確かにまずは293Tで条件検討をするのがいいですね。ありがとうございます。やってみます。 > あと免疫染色などで探りを入れることもできるかと。 IFはこの抗体は強制発現系であってもworkしませんでした。

(無題) 削除/引用 No.4327-3 - 2015/08/09 (日) 11:22:02 - おお >核やデブリはこれで除けているでしょうけど、6000-8000g位でまわすとミトコンドリアや細胞の大きめの構造物が除けると思います。 えっとゴルジあたりになると微妙です。その辺はちょっと調べるか、実験的に確かめるかしてください。

(無題) 削除/引用 No.4327-2 - 2015/08/09 (日) 11:13:04 - おお >[Re:1] 膜フラさんは書きました : > 以下に方法をお示ししますが、おそらく可溶化の工程が良くないのだと思っています。 > 細胞はヒト血球系の浮遊細胞です。 > > 4x10^7 cellsの細胞をHBSSで洗浄後、低張液（プロテアーゼ阻害剤入り）1 mlで懸濁後、氷上で15分静置 > > 全自動の超音波発生装置にて5秒x2回行い、 この段階で細胞が壊れているかが一つのポイントだと思います。 >核やデブリ除去の目的で500xg, 10 min, 4度で遠心 核やデブリはこれで除けているでしょうけど、6000-8000g位でまわすとミトコンドリアや細胞の大きめの構造物が除けると思います。 > > 全量を超遠心用のチューブに移し、50,000xg, 2時間, 4度で遠心 > > 上清を捨て、100 ulのLaemuli 1x SDS-sample bufferを加え、良くピペッティングする > > 95度、3 min処理 > > 不溶性物質が明らかに見えるため、しつこく超音波処理（2-3分です） 不溶性物質にものがこないなら遠心して除く手もあると思います。超音波以外で溶かしたいなら室温で飽和した尿素を等量加えてるというのもありかと思います。尿素はchaotropic な作用があるのでかなりのものがとけるとおもいます。ただし尿素を加えた後はボイルしない方がいいです。また100-300mMのNaClにしてやるとある種の蛋白は溶出しやすくなると思います。 不溶性にほとんどものがくるなら、不溶なものを回収して尿素で溶かす手もあります。 >また完全に浮遊物をなくすためしつこく95度処理やsonicationを加えています。がこの工程が正しいとは思えず、みたいタンパク質があぐってしまったり、壊れてしまったりを想像しています。 よほどの超音波でないと蛋白が壊れることはないと思います。還元剤も入っているので酸化もそんなに気にならないと思いますしSDSを加えているので蛋白の構造が壊れることも気にしなくていいはずです。 > 今考えていることとして、1% Triton X-100ベースのregularなlysis bufferの200 ul程度を膜分画ペレットに加え、よくピペッティングしたのち、不溶性のものは500xg, 5 min程度の遠心で除き、上清に6x SDS sample bufferを加えてボイルをしようかと思っています。つまり、Triton-X100で目的のゴルジ局在タンパク質が膜から溶けでてくることが前提でのプロトコルです。 たいていその方法で取れてくるサンプルをtotal lysateとよびます。100%とは言い難いですが膜タンパク質を含めてたいていのものが抽出されるという風に思われているようです。第一選択といってもいい方法ですが、ターゲットが微量であれば検出が難しくなります。 Triton x114をつかえば膜タンパク質を濃縮することができます。そう言うのを利用したキットも出回っているようです。 > > ただ、細胞が増えるのも遅く、4x10^7もの細胞を増やすのは時間がかかるため手探りの条件検討はできにくいです。みなさまからのコメントを頂戴できますと幸いに存じます。 > 293Tをつかってどのフラクションに目的の蛋白がくるのか探ればいいんじゃないでしょうか? あと免疫染色などで探りを入れることもできるかと。

膜フラクションの可溶化方法 削除/引用 No.4327-1 - 2015/08/09 (日) 08:22:36 - 膜フラ お世話になります。 現在、極めて量の少ない内在性タンパク質の検出に試みています。 抗体は、過剰発現のものは検出できるため、workするはずです。 これまで３度行い、一番最初に行った際に検出することができました。が、再現が取れていません。 以下に方法をお示ししますが、おそらく可溶化の工程が良くないのだと思っています。 細胞はヒト血球系の浮遊細胞です。 4x10^7 cellsの細胞をHBSSで洗浄後、低張液（プロテアーゼ阻害剤入り）1 mlで懸濁後、氷上で15分静置 全自動の超音波発生装置にて5秒x2回行い、核やデブリ除去の目的で500xg, 10 min, 4度で遠心 全量を超遠心用のチューブに移し、50,000xg, 2時間, 4度で遠心 上清を捨て、100 ulのLaemuli 1x SDS-sample bufferを加え、良くピペッティングする 95度、3 min処理 不溶性物質が明らかに見えるため、しつこく超音波処理（2-3分です） 漸く均一な溶液になったら、SDS-PAGEを行う 以上です。 超遠心後の可溶化はできるだけ濃縮したいために直接SDSサンプルバッファーを加えていること、その量が少ないこと、また完全に浮遊物をなくすためしつこく95度処理やsonicationを加えています。がこの工程が正しいとは思えず、みたいタンパク質があぐってしまったり、壊れてしまったりを想像しています。 使用している抗体は、293Tに過剰発現させたライセートをたった0.05 ulをSDS-PAGEしても容易に検出できます。GFPを過剰発現させた293Tライセートには全く反応しません（ということは、293Tの内在性タンパク質もこの抗体では検出できないことも意味していますが・・） 今考えていることとして、1% Triton X-100ベースのregularなlysis bufferの200 ul程度を膜分画ペレットに加え、よくピペッティングしたのち、不溶性のものは500xg, 5 min程度の遠心で除き、上清に6x SDS sample bufferを加えてボイルをしようかと思っています。つまり、Triton-X100で目的のゴルジ局在タンパク質が膜から溶けでてくることが前提でのプロトコルです。ただうまくいく根拠はありませんが、このプロトコルではTriton X-100で溶解しないものを遠心で除くため（むりやり超音波をあてて壊そうとしないため）、綺麗な上清が得られるのではと期待していますし、過度な熱や超音波のあてないのでタンパク質は壊れにくいのではと想像します。 ただ、細胞が増えるのも遅く、4x10^7もの細胞を増やすのは時間がかかるため手探りの条件検討はできにくいです。みなさまからのコメントを頂戴できますと幸いに存じます。 どうかよろしくお願い致します。

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