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(無題) 削除/引用 No.4338-3 - 2015/08/16 (日) 13:02:24 - namo ご回答ありがとうございました。 混乱して投稿してしまった部分もあったのですが、調べたところ、いわゆるpseudogeneに はまってしまっていたようです。 増やしたい領域の前後、だいたい１ｋｂずつくらいで、primerを設計しようとしていたのですが、 （エキソン、イントロン含む）その領域中２−３ｂｐのみ違う別の領域が、複数あったという感じです・・。 この状況では、１ｂｐのみ他領域と異なるprimerがいいところという形でした。 これで、primer設計できませんとでてくれるかと思いきや、何故か問題なくピックアップしてくれました。（ミスマッチ２つ以上と言っているのですが、、実際は０−１bpでした。） エキソンはともかく、イントロンがkb単位でほぼ同一なことがあるとは予想していなかったので、pseudogeneについては、いい経験になりました・・。 とりあえずbowtie系のソフトを使って（これは同一領域を検出できたので）、primerを再発注しました。

(無題) 削除/引用 No.4338-2 - 2015/08/14 (金) 23:16:36 - おお 似た配列があったとしても、プライまーの部分が似てなかったらPCRはかからないと思いますけど。 またRT-PCRなら発現しているRNAをもとに特異的なプライまーを選択できるかと思いますので、染色体上の似た配列は関係ない場合もあるかと思います。 そのプライまーを入力してデーターベースをあてて再試行したらどうなりますか?

primer blastの特異性 削除/引用 No.4338-1 - 2015/08/14 (金) 16:28:55 - namo ある遺伝子領域をPCR増幅しようと思い、NCBIのprimer blastを使ったのですが、 primer配列の特異性に疑問を持っています。 というのも、目的配列を５kbpくらいblastにかけたところ、複数の染色体上に似た配列があることがわかりました。pseudogeneやら遺伝子間やらがヒットしましたが、９５ー９７％相同性があるものが複数あり、非常に厄介です。目的領域がのっている染色体とは別染色体上にあるので、トランスポゾンのように飛んで入ったり、妙なことが起こっているのではないかと推測しています。 そこで、primer blastで、特異的なprimer配列を検索したのですが、 出てきた候補配列と、blastのデータを見比べると、別に特異的でない領域にprimerがデザインされていました。 primer blastは、特異性に問題はないのでしょうか？特異的なprimerを見つけられるところが アドバンテージだとおもっていたのですが・・。 もしくはblastのデータのほうが、何か間違っているのでしょうか？（見方に問題が有るなど。）

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