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(無題) 削除/引用 No.4353-5 - 2015/08/21 (金) 13:42:56 - sss おお様 ありがとうございます。 一度それでチャレンジしてみます。

(無題) 削除/引用 No.4353-4 - 2015/08/20 (木) 23:46:53 - おお どの様な実験を考えていらっしゃるかわからないので、何ともいえませんが、TX100の不溶画分をつかって実験したというのは方法論もクリアーですし、場合によってはありかと思います。 TX100を含むバッファーでサンプルをけんだくして、遠心せずにたとえば100ulとり(のこりはTX100だけのlysateとして使用)、さらにそこに10ulの20%SDSを加えるとかいうのであれば、TX100-SDSを含むバッファーで溶出したといえますし、2段階の溶出のバイアスはいくらか減るのではないかと思います。

(無題) 削除/引用 No.4353-3 - 2015/08/20 (木) 23:11:03 - sss おお様 再溶解は、1% Tritonで溶解したsampleをvortexし、分散させた後(見た目では不溶性の部位も分散しているように見えます)2% SDSのbuffer(2-mercaptoethanolを含まない)で溶解しようと考えています。 おお様のおっしゃる通り、SDS含有bufferで直接組織を可溶化した方が良いとは思いますが、同様のsampleを用いて別の実験・解析も並行して行っています。その実験が1% Tritonで組織を溶解しなければ都合が悪いので、このような二段階の溶解を行っています。

(無題) 削除/引用 No.4353-2 - 2015/08/20 (木) 22:52:55 - おお 再溶解って具体的には何をするんでしょうか?Tritonで抽出できなかったものをSDSで溶解するんでしょうか? もしそうなら蛋白量がそろっていても、各段階の溶出がそろっているかという点で不安が残りますが。 BCAじたいはSDSが入っている状態で私はよくはかります。上限さえ(どれくらいまでいいかわすれましたが)こえなければいいかとおもいますけど。

sds細胞溶解 BCA法 削除/引用 No.4353-1 - 2015/08/20 (木) 21:58:52 - sss いつも勉強させていただいています。 現在、組織のウエスタンブロット法を試みています。 BCA法でタンパク量を均一に揃えようとしています。 組織は1% Tritonを含むLysis bufferで溶解していますが、組織にはどうしても可溶化できない領域もあるため、Lysis bufferだけでは全タンパク量を溶解できません。なので、2%程SDSを含むbuffer(protease inhibitorを含む)で再溶解しBCA法を行い定量を試みようと考えています。 しかし、BCA法の条件はクリアでき、また、原理的には問題ないと思いますが、これで大丈夫かどうかは自信がありません。 どなたかアドバイスをいただけると幸いです。 よろしくお願いします。

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