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TUNEL（アポトーシス）の組織染色にはどのKITがお勧めですか？ トピック削除
No.4419-TOPIC - 2015/09/15 (火) 08:25:16 - AKI
いつも勉強させていただいています。
以前にもWakoのTUNEL染色が上手く染まらないというものがあるのを拝見しました。私は、マウスの胎盤でのTUNEL染色をしているのですが、ポジチィブコントロールとしてDNase処理したものも染まりません。引用文献なども見て、抗体反応時間を伸ばしたりしたのですが、全く染まらないんです。古くから使われている方法ですし、何か見落としや勘違いがあるのかな？と思うのですが、ポジコンすら染まらないことで、試薬の変更も考えています。お聞きしたいのは、
１）マウス組織が染まりにくいとかありますか？
２）ここを改善したら、よいかも？というところがあれば教えて下さい。
３）今は、Wako Apoptosis in situ detection kitを使っていますが、これ以外のKitで良かったよ、というものがあれば
教えて下さい。
　
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No.4419-7 - 2015/09/18 (金) 15:40:07 - 村人
Wako でも染まりますがね。TUNEL だけ染めて発表すると定番の質問が、DNA のフラグメントを認識してるんだからネクローシスかもしれない、という質問。組織形から、これがネクローシスかアポトーシスかもわからんのかい！、と言いたくなりますが、そいう方々のためにも　Cleaved Caspase　も染めておいたほうがいいですよ、老婆心ながら。

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No.4419-6 - 2015/09/16 (水) 09:46:21 - AA
大変失礼しました。
ご指摘の通りフルオレセイン標識NTPに対する抗体でした。
in situ などと同じですね。

AKIさん
自分の無知を棚に上げてあげつらうようなことを言ってすみませんでした。

(無題) 削除/引用
No.4419-5 - 2015/09/15 (火) 21:47:04 - apo
Wakoは説明書をみる限り、抗体のようですよ。
基質の詳細が書いてませんが、BrdUなどじゃないでしょうか。

ポジコンでも出ないということですが、permeabilization、酵素の反応時間（TdT、DNase）を振ってみて、ネガコン（TdTなし、抗体なし）と比較して発色がでる条件を探してみるとよいと思います。抗体も酵素も核まで入らないと検出できないので、permeabiliazationまで処理した試料を核タンパク質の抗体で染めてみると、透過性については確認できます。

他社キット（確かPromega）を用いて蛍光で検出したことがありますが、培養細胞ではDNase処理ですべての細胞が陽性になります。

(無題) 削除/引用
No.4419-4 - 2015/09/15 (火) 20:05:14 - AKI
ご返信ありがとうございます。
一度他社のキットも試してみます。
それと、ＴdTでの標識を抗体反応と書いていました。分かっていなくて恥ずかしいです。ご指摘ありがとうございます。

(無題) 削除/引用
No.4419-3 - 2015/09/15 (火) 12:25:09 - おお
細胞ですが、rocheのキットを必要なときはつかってます

(無題) 削除/引用
No.4419-2 - 2015/09/15 (火) 10:57:17 - AA
私はPromegaのkitを使用しています。(DEADENDシリーズ)
ただし、HRP反応の際は付属のDABは使わず別個に購入したものを使っています。
一度、元論文を参考に内容物を個別に購入してバッファーを自作し、
コスト節約を目指してみましたがやはりkitの感度と
コントラストの良さにはかないませんでした


ところで、TUNELに抗体反応ってありましたっけ？
TdTで断片化DNAの末端にビオチン化NTPを標識して、
HRP標識や蛍光標識のアビジンで検出するのでは・・・・？

TUNEL（アポトーシス）の組織染色にはどのKITがお勧めですか？ 削除/引用
No.4419-1 - 2015/09/15 (火) 08:25:16 - AKI
いつも勉強させていただいています。
以前にもWakoのTUNEL染色が上手く染まらないというものがあるのを拝見しました。私は、マウスの胎盤でのTUNEL染色をしているのですが、ポジチィブコントロールとしてDNase処理したものも染まりません。引用文献なども見て、抗体反応時間を伸ばしたりしたのですが、全く染まらないんです。古くから使われている方法ですし、何か見落としや勘違いがあるのかな？と思うのですが、ポジコンすら染まらないことで、試薬の変更も考えています。お聞きしたいのは、
１）マウス組織が染まりにくいとかありますか？
２）ここを改善したら、よいかも？というところがあれば教えて下さい。
３）今は、Wako Apoptosis in situ detection kitを使っていますが、これ以外のKitで良かったよ、というものがあれば
教えて下さい。
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