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(無題) 削除/引用 No.4446-8 - 2015/10/01 (木) 19:45:32 - MP ウイルス上清原液を使っているとなると、アミコンでの濃縮はあまり意味がないかもしれませんね。せいぜい２０〜４０倍程度の濃縮で、それを新鮮な感染細胞用の培地で薄めて使っているだけなので、最終的なウイルス量はさほど変わらない。超遠心がやはり確実でしょうか。

(無題) 削除/引用 No.4446-7 - 2015/10/01 (木) 01:55:46 - れんち mon様 このようなきちんとしたプロトコルがあるとは知りませんでした。 お示し頂きありがとうございます！！早速読んでみたいと思います。 もしわからないことがありましたらどうかまたご相談、ご教授いただけますと幸いに存じます。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.4446-6 - 2015/09/30 (水) 20:24:29 - mon ttp://www.nature.com/nprot/journal/v4/n4/full/nprot.2009.22.html なぜか当該PDFがDLできるリンクが別にあるけど....。

(無題) 削除/引用 No.4446-5 - 2015/09/30 (水) 16:07:00 - れんち MP様 アミコンの限外濾過がウイルスの濃縮に使えるとは思ってもいませんでした。 お手すきの際に、具体的なスケールを教えていただけませんでしょうか？ 私はいつも6-well plateでウイルス上清2 mlを原液のまま、T25のフラスコ内で飼っている細胞に2 mlを加え、その2 mlのみで一晩培養しています。一晩経ちましたら5 mlのconplete mediumを加えています。 FACSは48-72時間あたりで調べています。 具体的にどれくらいの培養上清を何ミリリットルまで濃縮し、それを原液か何かで何倍かで希釈して感染に用いる、などの情報をシェアしていただけますととても嬉しいです。 お手すきの際で結構ですので、ご教授お願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.4446-4 - 2015/09/30 (水) 16:00:56 - れんち み様、MP様 ご教授、ありがとうございます。PEG-it使われているのですね。 はい、気になるのがpackaging cellsへのtransfection効率が低いということです。 やはりそこをもっと気にするべきでした。 pEGFP-N1を293TにPEI maxにて遺伝子導入すると、7-8割は入ります。 細胞毒性もありません。PEI (27 ug) : DNA ( 3 ug) =9 :1でやっています。 一方、レンチウイルス用プラスミド+pMD2.G (vsv-g) +pLV-HELP (gag, pol, rev, tat)を各3 ugずつに、PEImax 27 ugを加えて10%血清+ DMEM(+ antibiotics)で2日間transfectionしっぱなしです。その上清をフィルトレートして、polyybrene 5 ug/mlになるよう加えて細胞に感染させています。 ちなみにレンチ用プラスミドにはEGFPがIRES下で発現するようになっており、pEGFP-N1の時の蛍光強度に比べると圧倒的に低く、導入効率もFACSの結果から3-4割といったところです。 ここをインサートは3-4 kbほどあるし、IRES下のEGFPの発現が下がっているのかなと思っていましたが、もうすこしここを疑問に思い、改善の方法を探るべきでした。 みなさまは293Tへの導入には何を使われていますか？あるいは、私のトランスフェクションの方法で問題なところがありましたら、どうかご指摘いただけますと幸いに存じます。

(無題) 削除/引用 No.4446-3 - 2015/09/30 (水) 13:59:10 - MP 値は多少張りますが、Amicon ultra 100K が簡単です。 ウイルス液を繰り返し足していけば、理論的にはいくらでも濃縮できますが、100K以上の蛋白（グロブリンなど？）も濃縮されてしまうので限界はあるとは思います。 PEG-itも簡単でよいですが、PEGの細胞毒性が気になるところです。

(無題) 削除/引用 No.4446-2 - 2015/09/30 (水) 13:01:22 - み >[Re:1] れんちさんは書きました : > > ウイルス自体は、6-well plateにまいたパッケージング細胞(293T)に目的のプラスミドのほか、ウイルスコンポーネント用プラスミドを共発現させ、48時間後の培養上清にポリブレンを加えて目的の細胞に感染させています。（濃縮なし） 72時間あるいは場合によってはそれ以上に回収時間を引き延ばしても良いのでは？ > > ウイルス液を濃縮すれば、感染効率はあがるでしょうか？ PEG-itは問題なくワークしていますけどね。 最近はPEG粉末購入して自作した同等試薬でも上手くいっている。 plasmidサイズが大きくなって問題が発生しているようですが、ウイルス作製用の細胞へのtransfectの効率が落ちている可能性は？

レンチウイルスの濃縮法でおすすめを教えてください。 削除/引用 No.4446-1 - 2015/09/29 (火) 14:50:15 - れんち お世話になります。頻出するトピックだと思いますが、最近のアップデートを含めて皆様のご意見ご感想をいただければ幸甚です。 個人的なことですが、3 kbのインサートをレンチベクター（IRES-EGFP）に導入し、ウイルスを作らせると、細胞の0.1%ほどしか感染しません。 インサートなしのIRES-EGFPのみだと、ほぼ100%の細胞がEGFPを発現し、感染しています。1 kb増すごとに１オーダー、ウイルスタイターが落ちるなんてことも昔のトピックでみました。 ウイルス自体は、6-well plateにまいたパッケージング細胞(293T)に目的のプラスミドのほか、ウイルスコンポーネント用プラスミドを共発現させ、48時間後の培養上清にポリブレンを加えて目的の細胞に感染させています。（濃縮なし） ウイルス液を濃縮すれば、感染効率はあがるでしょうか？ どのような方法がコモンでしょうか？以前にPEG-itというPEGを用いた商品を試したことがあるんですが、あまりうまくいった試しがありません。最近のアップデートも含め、どういった方法で感染効率をあげるのが一般的でしょうか？ 稚拙なトピックで恐縮しております。が、ご意見ご感想ありましたらご教示いただけますと幸いに存じます。

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