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(無題) 削除/引用 No.4453-15 - 2015/10/06 (火) 13:17:25 - しー 横からですさん ありがとうございます。 うちのラボではトリプシンで処理することはありますが、ペプシンで処理する方法はやったことがありません。 もし良ければ、プロトコルをお持ちでしたら教えて頂けませんでしょうか。 抗体のバンドについては、分子量マーカーでとの比較で行っています。 横からですさんのようにノックアウトがあれば、それで確認するのがベストだとは思うのですが、当方はもっていないのでそのような方法でしか確認していません。

(無題) 削除/引用 No.4453-14 - 2015/10/06 (火) 08:49:47 - 横からです 培養細胞（プライマリ軟骨細胞）などではそうしていました。 私のラボではノックアウトがいますので、特異的なバンドであることは確認しています。 しー様は未処理でウエスタンを行っているとのことですが、抗体の特異性はどのように保証されていますか？サンプルをペプシン処理するのが一般的ですし、クロスリンクしているものをウエスタンで示されてもレビューアーが指摘するのではと恐れて私は面倒ですが、毎回酵素消化しています。 もし特異的なバンドなのであれば、手数を踏まないで調製できるということで魅力的ではあるのですが。

(無題) 削除/引用 No.4453-13 - 2015/10/05 (月) 11:43:03 - しー 横からですさん ありがとうございます。 組織からコラーゲンtype1や2をwesternで見る際には、ペプシンなどの酵素で処理することは論文でよくみかけるのですが、培養細胞でも一般的なのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.4453-12 - 2015/10/03 (土) 22:14:47 - 横からです しーさん、 コラーゲンtype1や2をwesternで見る際には、酵素で消化して、透析後にSDS-PAGEするというのが一般的だと思うのですが、それでなくても多量体として問題なく見えるのでしょうか？ 免疫組織染色でも同様で、ペプシン, pH2やトリプシンで抗原の賦活化をしないとシグナルが見えません。

(無題) 削除/引用 No.4453-11 - 2015/10/02 (金) 17:03:10 - しー おおさん 間違いに気付き、一度コメントを削除して書き直しました、すいません。 教えて頂いたやり方でトライしてみます。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.4453-10 - 2015/10/02 (金) 12:01:52 - おお あれ、書き込みをしようとしている間にコメントが変わったような、、、代用です。最終濃度が50mM-100mMになるようにすればいいです。

(無題) 削除/引用 No.4453-8 - 2015/10/02 (金) 11:58:52 - しー おおさん ありがとうございます。 早速、尿素でやってみたいと思います。 DTTはメルカプトエタノールの代わりに使用するという理解で問題ないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.4453-6 - 2015/10/02 (金) 01:40:04 - おお 3量体が見えてるのかなと思ったのです。通常SDSPAGEでは蛋白どうしの結合は見れませんが、ごく一部の蛋白はSDS存在下でも解離しないものもあるようですので。 いまサンプルバッファーにサンプルがとけているなら、尿素を室温で飽和状態になるまで溶かして1:1で混ぜて室温で5分くらいおいてえいどうするてがあります。 running gelに尿素をいれる(6M ぐらい)手もあるかと思います。それならtransferの効率が変わるかもしれませんのでえいどう後5分ぐらいrunning bufferに浸しておく方がいいかもしれません。 Lysateの段階からいれるてもありますが、そうした場合はboilをさけたほうがいいです。なのでsample bufferはDTTを使った方がいいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.4453-5 - 2015/10/01 (木) 16:17:01 - しー 独り言さん トランスファーは問題なくできているのではないかと思います。 コラーゲン2以外の他の高分子量のタンパク発現を確認しているわけではありませんが、コラーゲン2の発現を見たときにコラーゲン2と思われるバンドがマーカーよりさらに上の方にバンドがでていました。

(無題) 削除/引用 No.4453-4 - 2015/10/01 (木) 16:12:12 - しー おおさん 可溶化の使い方が悪かったのかもしれません。 本来なら190kDaでバンドがでるはずなのですが、 マーカーの256kDaよりかなり上にバンドがでます。 そういう意味では可溶化はできていると言えるでしょうか。 知識不足なのであっているかわかりませんが、 他の分子がくっついていることでこのようなことが起きているのでは、 と考えています。 コラーゲン2は3量体です。 教えて頂きたいのですが、尿素処理を行うことで どのようなことが起きるのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.4453-3 - 2015/10/01 (木) 13:27:07 - 独り言 コラーゲンが溶けにくいのかどうか知りませんが、可溶化がうまくいっていないという根拠はなんでしょうか？ むしろウエスタンで高分子のものが見えないのは、高分子のタンパク質のトランスファーがうまくいっていないことが多いように思います。他の２００ｋDa 以上のタンパク質ではウエスタンはばっちりできていますか？ バッファーのメタノール濃度を下げたり、トランスファーの時間を長くしたりとかで改善しませんか？

(無題) 削除/引用 No.4453-2 - 2015/10/01 (木) 13:06:48 - おお 256kDaのものが溶液中にあるんだから可溶化されているんですよ。可溶化しやすいとかしにくいとかは分子量よりも他の要因の方が大きいと思いますし。 おそらくコイルドコイルで単量体にならないと思っいるのだと思いますが、、、それってコラーゲンはtrimerでしたっけ、ちょっと小さいですね。 まそれはともかくそう言うことならば尿素とかだめかなと漠然と思うけど、経験はありませんので保証はできません。

高分子の可溶化について（コラーゲン2） 削除/引用 No.4453-1 - 2015/10/01 (木) 12:39:08 - しー ATDC5細胞を軟骨細胞に分化誘導し、コラーゲン2の発現をウエスタンで調べていますが、高分子の可溶化ができないせいかマーカー（256kDa）の上にバンドがでます。 ちなみに今はSDS-Lysis bufferで細胞を溶解、メルカプトエタノールを加えて5分間沸騰させたものを電気泳動しています。 抗体の問題もあるかとは思いますが、高分子の可溶化について何か良い対策があればご教示頂けませんでしょうか。 よろしくお願い致します。

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