BioTechnicalフォーラム [DNA回収率の高いDNA精製法]

DNA回収率の高いDNA精製法

No.4455-TOPIC - 2015/10/01 (木) 15:16:46 - 名無し

ラフにとった微生物のゲノムDNA溶液があります（フェノクロ存在下でビーズビーダー破砕、EtOH沈で回収したもの）。

除タンパクを目的としたDNA精製をおこないたいのですが、DNA回収率が高い簡便で精製法として何を選択すると良いでしょうか？

フェノクロ抽出、酢酸アンモニウム沈殿、AMPure XPなどが思い浮かびますが、何かコメント頂ければ幸いです。遠い昔の記憶ではフェノクロではＤＮＡが有機層に移行するのでロスると聞いたことがありますが、再回収すれば回避できるのでしょうか？

ちなみにDNA溶液の濃度は100ng/ul程度です。精製度は酢酸アンモニウムでタンパクを塩析除去した程度を目指しており、精製後のDNAはPCRに用いる予定です。グループ間で配布してgenotypingの練習を行う予定です。

宜しくお願いします。
　

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No.4455-10 - 2015/10/02 (金) 13:23:48 - AP

>確かに水溶性物質のDNAが有機層に移行することを懸念するのはナンセンスですね。

ナンセンスと切り捨ててしまっていいもんでもないと思いますけどね。
酸性条件では電離しないためDNAは非極性になりフェノール層に入り込みます。
ですからフェノールで抽出すりゃいいんだよねと、水飽和のフェノールで抽出してしまうとDNAを失います(RNAは未電離でも極性があるため水層に残る）。塩基性～弱塩基性のバッファーで繰り返し飽和させて弱塩基性にしたものを使わなければなりません。

ちなみに、
RNA精製のAGPC法（Trizolなど）は酸性条件でフェノールで抽出することでRNAを水層に残し、DNAを中間層・フェノール層に分離します。
そもそも、フェノール抽出ってタンパク質を精製法するための方法で、夾雑するDNAをフェノール層に吸収させて除くというのがオリジンだとか。

(無題)

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No.4455-9 - 2015/10/02 (金) 12:15:38 - おお

>透析膜の用意やしごいて回収する必要がある（？）、というところが未経験者にはハードル高そうです。原理的には回収率高そうですね。

むかしゲノムのライブラリーを作るためにintactにちかいDNAをとるために、にたような方法をしていたようです。実際はとうせきというより、陰圧にして膜の向こうにある溶液を引き落として、じゃんじゃん流すって感じ。

えっと1.5mlぐらいのチューブのふたに透析膜をつけたものが売ってますのでそう言うのでもいいですが、ポアのサイズはよくつかわれる塩が抜けるものよりかなり大きいものの方がいいと思います。そう言うサイズのがうっていればいいですけど。そう言うチューブなら膜がついた蓋のままえんしんするとすべてDNAは底にかいしゅうされます。

スクリューキャップの蓋でそう言う透析ができるやつがおおいので、蓋を普通のキャップにかえればそのまま保存できます。

透析もグアニジンでしたあと、さいごTEで置換してしまえば、回収後そのままつかえます。ただ陰圧で流していたプロとコールを拡散で補おうとしているのでどこまで効率よくできるかわかりません。3日ぐらい透析し続ければ何とかなるかなぁと楽天的なかんがえです。

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No.4455-8 - 2015/10/02 (金) 11:17:33 - 名無し

>以下のHPのresultでは
https://www.yodosha.co.jp/jikkenigaku/nucleic_acid/vol1.html

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No.4455-7 - 2015/10/02 (金) 11:15:46 - 名無し

APさん、

コメントありがとうございます。確かに水溶性物質のDNAが有機層に移行することを懸念するのはナンセンスですね。

PCI抽出の回収率が高い（例えば9割以上）と期待できるのであればPCI抽出のみを採用しようと思います。酢酸アンモニウムによる塩析ですが、以下のHPのresultではプラスミド回収率が8割となっています。安全性的には酢酸アンモニウムを採用したいところですが、回収率が減るのであればにはPCI抽出のみが私には向いていそう。バックエクストラクトの手間および手技によるバイアス(中間層を取らないように回収するテクニック)を回避するためにphase lock gel(有機層と水槽を分けるゲル)を採用すればよいと考えています。

monさん、
コメントありがとうございます。シリカはお手軽でキレイという印象があります。反面、ゲノムDNAだと収量（ひっかかる？）とDNAの分断が怖いという印象があります。今回はできれば９割程度の高回収率を目指したいと思いますのでそのような観点で検討してみます。

おおさん、
いつもユニークな意見をありがとうございます。グアニジン透析ですか。透析膜の用意やしごいて回収する必要がある（？）、というところが未経験者にはハードル高そうです。原理的には回収率高そうですね。

横ですが、祖抽出DNA液を対象とした場合のPK処理+PCI抽出orPCI抽出のみ、の決定的な違いというのはどう考えればいいのでしょうか？前者だとタンパク量が多くても対応できるとか、ヒストンなどの核酸修飾タンパクは前者じゃないと除去しがたい、といった利点があるのでしょうか？それとも祖抽出DNA溶液になっているんだからPK処理をする積極的な意義は特にないと考えていいのでしょうか？

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No.4455-6 - 2015/10/02 (金) 09:34:51 - AP

>塩化アンモニウム

酢酸アンモニウムの間違いです。

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No.4455-5 - 2015/10/02 (金) 01:08:49 - おお

PK処理してひたすらグアニジンで透析っていう方法があるよ。

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No.4455-4 - 2015/10/01 (木) 19:57:35 - AP

>遠い昔の記憶ではフェノクロではＤＮＡが有機層に移行するのでロスると聞いたことがありますが、

そりゃ、迷信か下手な人の寝言でしょう。
ちゃんとpH8程度にバッファーしたフェノール（もちろん酸化していない物）なら（さらにクロロフォルムが入っていればなおさら）有機相に行くことはありません。収量にシビアな実験ならバックエクストラクトしますが、ふつうは必要ありません。

(無題)

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No.4455-3 - 2015/10/01 (木) 19:52:47 - AP

どれを選んでも、目的は達するでしょう。
あとは、利用可能な材料はなにかとか、スケールはどれくらいかとかで、適した方法を選べばいいんじゃないかな。

あえて言えば、
ゲノムDNAのように高分子量のDNAの場合は、シリカなどに吸着する方法だと、他の方法に比べ機械的にせん断される度合いが大きい、ゲノム用のキットでも収量が低くなりがち、小スケールに限られる。エタノール沈殿でDNAの糸が見えて、ガラス棒で巻き取れるくらいのスケールや分子量の高さは望めない。まあ、PCRに使うんだったら十分でしょうが。AMPureも微小スケールなら収量、純度とも大いにメリットがあるけれど、ちょっとスケールが大きくなると、操作上もコスト的にも不利だと思います。

その点、PCI抽出ならオールマイティーじゃないでしょうか。
私なら、塩化アンモニウムで塩析した後、上清をふPCI抽出、エタノールのみ加えてEtOH沈殿して回収ですかね。

(無題)

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No.4455-2 - 2015/10/01 (木) 18:50:21 - mon

回収率が他の方法より高いか否かは知りませんが、面倒がないのは、市販のミニカラムかな。
安価に行いたいなら、silicon dioxide (silica powder）かな。
例えば、"silica DNA"や"silicon dioxide DNA"で検察するとprotocolが見つかります。

DNA回収率の高いDNA精製法

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No.4455-1 - 2015/10/01 (木) 15:16:46 - 名無し

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