とても初歩的な質問で申し訳ないですが、アドバイスをいただけましたら嬉しいです。
私は今、HE K293T細胞の免疫染色を行っています。
24穴プレートに、円形のガラスを入れ、0.2%Gelatinで37度、10分コートしたのちに、 HEK293T細胞を5x10の4乗個撒いています。
37度, CO2インキュベータにて24時間後ではまだ一部の細胞がややround shapeでしたので、さらに6時間ほど培養を加え、トータル30時間目に細胞を-20度メタノールで固定し、染色を開始しました。
5x10E4個はやや多いかもしれませんが、細胞は均一にまけています。
293T細胞を染めることは初めてです。ただ、すぐに剥がれやすいだろうという印象を持っていましたので、最初から慎重に丁寧に染色を試みました。
ブロッキングや洗浄、抗体反応時にはなるべく乾かさないように素早く行うことに努め、また、溶液の添加や洗浄液の添加は口の大きなスポイトを用い、ガラスに直接液滴を落とさないように縁から加えるよう努めました。吸引は、アスピレータを用いましたが、この時、細胞が剥がれて吸われていくのが目で確認できました。
結果は、円の中央部はほとんどすべての細胞が剥がれ落ちました。
縁には細胞が残っていたのですが、なんとなく、縁の部分は染色にムラがある気がして、できれば中央部のところで画像取得できればと思っています。
293T細胞を細胞染色された方がいらっしゃいましたら、コツなどありましたらシェアしていただけないでしょうか？当方、もっぱら血管内皮細胞や線維芽細胞を免疫染色しており、その際には問題はありません。293T細胞の接着力の低さに起因しているものと考えています。
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