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(無題) 削除/引用 No.4470-4 - 2015/10/08 (木) 09:09:50 - mon RNaseがどこからくるか考えたことはありますか？ おおさんが指摘していますが、正常な細胞内でRNaseが問題になるくらいactiveなら細胞は生きていけませんよ。 細胞がダメージを受けて、細胞外からRNaseが流入してくる、細胞内で厳密に制御されているRNaseが制御不能になる、ある種のシグナル伝達系で選択的？RNA分解が起こる等が考えられますので、それらが生じないような方法を検討してください。 コラゲナーゼで分散後細胞を選抜する操作で細胞がダメージを受けることやある種のシグナルが細胞内に伝わり細胞内の様子（RNAの動態も含む）が変わることは十分考えられます。そのため、選抜細胞のRNAを調べた後も、その結果が元の臓器の状態を反映しているかの検証が必要だと思われます。 なお、RNAlaterは高張液で細胞の脱水作用があると考えられますのでそれを除去すると細胞にダメージが残ると思いますが（経験はないので結果は知らない）。

(無題) 削除/引用 No.4470-3 - 2015/10/08 (木) 06:31:43 - おお >そこでコラゲナーゼ処理をして、培養をせずにマグネット付き第２抗体を使った精製をしてみようと考えました。しかし、その場合でも、内在するRNaseによってRNAが分解してしまう可能性が考えられます。 細胞の状態がよければあまりRNaseの心配はしなくていいような気がしますけど、、、

(無題) 削除/引用 No.4470-2 - 2015/10/08 (木) 06:29:07 - おお 感覚的にimpossibleのようなきがします。 RNAの収量がひくいのはなぜだと思いますか?もともとターゲットの細胞が少ないからですか? 分解しているとお考えですか?ならばその根拠は?

RNAlater処理後にコラゲナーゼ処理できる？ 削除/引用 No.4470-1 - 2015/10/08 (木) 05:25:26 - ルナ よろしくお願いします。 複数種類の細胞からなるある組織から、特定の細胞の膜表面のタンパクを認識する抗体を用いてその特定の細胞を精製し、精製細胞内のRNAを分析したいのです。 これまでにコラゲナーゼ処理をして数日培養をしてから、その抗体を用いてセルソータによる精製や、マグネット付き第２抗体を使った精製をしてみました。しかしRNAの量は非常に少なかったです。 そこでコラゲナーゼ処理をして、培養をせずにマグネット付き第２抗体を使った精製をしてみようと考えました。しかし、その場合でも、内在するRNaseによってRNAが分解してしまう可能性が考えられます。 そのためRNAlater処理後にコラゲナーゼ処理できないかと考えたのです。 心配な点は次の２点です： （１）RNAlaterの有効成分の硫安の存在下ではコラゲナーゼが作用できないのではないか （２）RNAlaterを除去した後だとRNaseが作用をはじめて、37度40分のコラゲナーゼ処理の間にRNAが分解してしまうのではないか どなたか御経験のある方、いらっしゃらないですか？そのような論文の紹介でもかまいません。 あるいはもっと良い方法は無いでしょうか？

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