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(無題) 削除/引用 No.4528-8 - 2015/10/28 (水) 02:11:55 - Houston おおさん ご丁寧に教えて頂きありがとうございました。 ビーズでトライしてみます。

(無題) 削除/引用 No.4528-7 - 2015/10/28 (水) 00:56:35 - おお サンプル量にもよると思いますが、100ulぐらいであればチューブに20ulぐらいの液がはいった高さを目安にすればいいかと。細胞のボリュームほどあればいいかと思いますが、ちょっと粒子が粗いので、、、 もう一まわり小さいのでもいいのかもしれませんが、どんなのがあるかちょっと調べたことがありませんので。

(無題) 削除/引用 No.4528-6 - 2015/10/27 (火) 23:58:21 - Houston おおさん 製品の紹介頂きありがとうございます。 ぜひ、これで試してみたいと思います。 度々申し訳ないのですが、これは液状になっていないと思うのですが、実際にRIPA lysateにはどのくらいの量をどのように添加しておられるのでしょうか？ チューブの底に溜まるくらいを目安に入れるとかそういった感じでしょうか？ よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.4528-5 - 2015/10/27 (火) 08:06:08 - おお http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g8772?lang=en&region=US うちはこれがあったので、これを使っています。 acid washedがいいと思います。 ほかの人がどうしているかはいろいろありますが、RIPAよりもマイルドな方法とか1%TX100だけのdetergentにするとか(溶出力がよわくなりますが)、核蛋白が抽出できるけど、クロマチンが溶出しないぎりぎりの塩濃度つかうとか(250-300mM NaCl)とかいろいろだとは思いますが、私が答えるより、ほかの人が答えた方がいいか。。。 もちろん超音波、ニードル、ビーズによる破砕もポピュラーではあると思います。

(無題) 削除/引用 No.4528-4 - 2015/10/27 (火) 07:09:04 - Houston 早速のお返事ありがとうございます。 ボルテックスさん コメントありがとうございます。このミキサーで混ぜるときはon iceでなくなってしまうとおもうのですが、大丈夫でしょうか？また、蛋白は泡立てるなと教わったのですが、ガンガンボルテックスしても大丈夫なものでしょうか？それとも、これはsample buffer入れてboilした後のサンプルをするという意味でしょうか？ おおさん コメントありがとうございます。このグラスビーズ法は魅力的なので、調べてみるとsigmaで取り扱っていたのですが、ビーズのサイズや酸で洗ってあったりと色々ありました。もしご存知でしたらどこのメーカーで、どのくらい入れると良いかアドバイス頂けますでしょうか。 それと、いずれの教えて頂いた方法もプロトコールにいつも乗っているようなものではないような気がします。でも、僕が経験した限り何もしないとかなりの細胞株でこの現象が見られますし、とてもessentialな実験手技であることを考えると、普通は皆さんはどうやって対処しておられるのでしょうか？やはり超音波が一般的なのでしょうか？ よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.4528-3 - 2015/10/27 (火) 06:51:21 - おお RIPAにglycerolをくわえて10-20%ぐらいになるようにしてみてください。 少し溶出条件がマイルドになるようで、クロマチンが崩壊せずDNAが溶出しないようです。 ただし、グリセロールを使うとBCAでの蛋白定量でバックが上がります。Bradfordは使えると思います。 あるいはグラスビーズを少量入れるとグラスビーズにDNAが吸着しますので遠心後ビーズがDNAを巻き込みそこにたまるので、DNAがかなり除けます。

(無題) 削除/引用 No.4528-2 - 2015/10/27 (火) 06:37:22 - ボルテックス マイクロチューブミキサー http://bio.tomys.co.jp/products/bio/micro_tube_mixier/ とかで数分、最大に近いパワーで混ぜると良かったかなと思います。ボルテックスでも可、ただし手が痛くなる。ボルテックスはそれに似たアダプターがあったような（不確か）。

WB lysate調整時のDNAの除去方法 削除/引用 No.4528-1 - 2015/10/27 (火) 05:16:42 - Houston WBのライセート調製について教えてください。 現在市販のRIPA buffer (PIERCE, Cat:89900)にHalt protease&phosphatase inhibitor cocktail(Thermo, Cat:78840)を入れたbufferで培養細胞からのライセート調製をしています。（5x105 to 1x106 cells / RIPA 100uL) 。 幾つかの細胞ではbuffer添加後ライセートが粘稠になり、遠心しても除く事が出来ません。DNAが溶け出しているのだろうという事で、ライセートを29Gの針に通したりもしていますが、少し吸いやすくなった程度で、サンプルバッファーを入れて加熱すると、また粘稠になり、結局電気泳動の際にサンプルをアプライするとウェルの中にスムーズに落ちて行かず、ピペットチップにくっついて、うまくアプライ出来ません。DNAを処理する方法として超音波、DNaseなどがあることを知りましたが、いずれも今のラボにはありません。（諸処の事情によりDNaseはうちのラボでは使用禁です）。何よりライセート調製はWBの最も基本的なステップだと思うので、何かもっと良い手があるのではと思い、皆様のお力を貸して頂ければと思います。 よろしくお願い致します。

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