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(無題) 削除/引用 No.4551-6 - 2016/07/08 (金) 12:53:39 - おお ターミネーター（に当たるもの）を念のためにタンデムに入れると言ったようなコンストラクトもあったような気がしますが、植物で通用するかどうかわからないですね。 例えばルシフェラーゼを使ったプロモーターアッセイ用のプラスミドは、興味があるプロモーターを入れるマルチクローニングサイトの直前にポリAシグナルを入れてます。リードするーやどこからともなく転写が始まったRNAにストップをかけてバックグランドなどを減らす目的です。もちろんルシフェラーゼの下流にポリAシグナルが入っているので、一見プロモーターもないところにもう一つポリAシグナルがある変なコンストラクトに思えるかもしれません。 とにかくフィードバックありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.4551-5 - 2016/07/08 (金) 10:06:18 - Tany お久しぶりです． ふと思い出しましたのでここに書き込ませていただきます． この質問の後，-[promoter]-[GFP]-[terminator]-[promoter]-[GUS]-[terminator]- というコンストラクトを構築し，それぞれの導入遺伝子が発現するかどうかをシロイヌナズナの葉にボンバードメントで打ち込んで確認しました． その結果，上流のGFPは問題なく発現しておりましたが，下流のGUS遺伝子の発現は確認されませんでした． 色々と調べてみると，このようなコンストラクトの場合に上流の遺伝子の転写がターミネーターで終結せずリードスルーしてしまうことにより，下流の遺伝子に対し転写干渉が生じる場合があるそうです． 一応，事前にこの点については考慮していて，リードスルーの起きにくいとされているターミネーターを使用したのですがダメでした． 解決策としては，おおさんの言及されているようなそれぞれの発現カセットの向きを逆にすることが良いのかなと思います． 以上，簡単にですが今後似たようなコンストラクトの構築を考えている方へのメモ代わりに．

(無題) 削除/引用 No.4551-4 - 2015/11/05 (木) 14:25:50 - おお プロモーターがお互い逆方向になるように並んでいて、そこから右回りと左回りの発現ユニットがあるコンストラクトを見たことがあるけどね。えっとmammalとかバクテリアだけど。

(無題) 削除/引用 No.4551-3 - 2015/11/05 (木) 13:02:44 - Tany >toto様 ご返信ありがとうございます． やはりやってみないとわからないというのが実際なのですね． 確かに，プロモーターのコア領域の位置なども大事に思います． 10ベース程度で特に問題がみられなかったというご経験は，私の気持ちの面でかなり楽にしてもらえます． ありがとうございました． 今回は，ターミネーターとプロモーターの間にスペーサーの意味もかねて制限酵素サイトを付加しようと思います(といっても10bp程度を稼ぐくらいですが)．

(無題) 削除/引用 No.4551-2 - 2015/11/05 (木) 11:32:03 - toto どこからも答えがないようですので、経験則だけですが、これはやってみないとわからないと思います。数ベースにしたことはありませんが、10ベースくらいでは問題ないこともありました。プロモーターの配列、といった場合に、どこまでをそう呼ぶかという事もあります。

発現ベクターにおいて複数の発現カセットをつなぐ際の注意点 削除/引用 No.4551-1 - 2015/11/04 (水) 11:42:32 - Tany いつもお世話になっております． ベクターの構築において気になる点がありますので質問させてください． 現在，植物用発現ベクターの構築を計画しております． コンストラクトの内容としては， -[promoter]-[GFP]-[terminator]-[promoter]-MCS-[terminator]- というようにGFPの発現カセットと，MCS内へ導入する遺伝子の発現カセットがタンデムに並ぶ構造となっております． 手元にあるベクターを改変して構築する予定なのですが，現在の計画ではGFP遺伝子の後のターミネーターと，MCSの前のプロモーターの距離が数bpのみとなります． このように，ターミネーターとプロモーターの距離が近すぎる場合に，発現量の低下などの影響は考えられますでしょうか? 調べては見たものの，このようなことを調べている報告にたどり着けませんでしたので，こちらで質問させていただきました． よろしくお願いいたします．

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