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(無題) 削除/引用 No.4553-9 - 2015/11/07 (土) 01:44:34 - おお >control 0 (ND, not detected)、あるものを基準としたtestの相対量をプロットした棒グラフ という文脈での「あるもの」というのはたとえば、サンプルCでの遺伝子X発現とかそういう理解で良いですよね。 yes

(無題) 削除/引用 No.4553-8 - 2015/11/06 (金) 23:02:12 - AA おお様 長文申し訳ありませんでした。 親身に対応いただきありがとうございました。 >control 0 (ND, not detected)、あるものを基準としたtestの相対量をプロットした棒グラフ という文脈での「あるもの」というのはたとえば、サンプルCでの遺伝子X発現とかそういう理解で良いですよね。 確実に遺伝子Xの発現があると分かっているサンプルCを用いれば確かに可能ですね。 サンプルCでの発現量を1として、それとの相対値でサンプルAとサンプルBの遺伝子発現量をそれぞれ表記するということですよね。 　なかなかどういったサンプルを基準とするかが難しそうではありますが。 そうすると確かに理論上は棒グラフで、表すことが可能ですね。 （そもそも鋳型をとって、絶対定量を行えばよいのだとは思うのですが。他の遺伝子たちもすべて鋳型をとってPCRをやり直すことを考えると、手間も検体も惜しいというのが本音です） 色々対応策を教えていただきありがとうございました。 しつこく聞いて申し訳ありませんでした。 お手数おかけいたしました。

(無題) 削除/引用 No.4553-7 - 2015/11/06 (金) 00:16:22 - おお 増幅効率がわからないならCt値ベースで表記してもいいかと思いますが、internal control に対する補正をどうするのかちょっとぴんと来ないです。。。 検量線書いているということなので、相対量は出ると思いますので、control 0 (ND, not detected)、あるものを基準としたtestの相対量をプロットした棒グラフはかけると思いますけど。

(無題) 削除/引用 No.4553-6 - 2015/11/05 (木) 23:54:40 - AA おお様 >そんな科学的根拠がないことがみとめられるでしょうか。 申し訳ありません。不勉強なまま書き込みをしてしまい。 おっしゃる通りです。 ΔΔCt値について理解しました。 勉強になりました。 PCR効率が同一でないと考え、基本的には、Eメソッドでやっておるのですが、その場合でも同様に考えて良いのでしょうか？ 例えば、 Aでの遺伝子X発現ゼロ Bでの遺伝子X発現と閾値線との交点が15サイクル AでのGAPDH発現量の閾値線との交点が20サイクル BでのGAPDH発現量の閾値線との交点が22サイクル であった場合（40サイクルまで増幅を行ったとします 御教授いただいた方法で計算を行いますと、Aに対するBのΔΔCt値>（22-15）-（20-40)=25という表記に出来るかと理解しておりますが、この場合、何倍かということになりますと、やはり増殖効率に関して補正をかけるということは難しくなりますでしょうか? 例えば上の例でいうと サンプルAとサンプルBにおける遺伝子X発現量の差。（Aでは40サイクルでも発現ゼロなので、その差は>40-15=25サイクル）を遺伝子Xに関する検量線上（サンプルCの希釈系列から作成）で、2の何乗の濃度差に相当するか求めて、例えば、25サイクルは直線上では2^24倍の濃度差であったとすると、増殖効率を考慮した濃度差は24サイクルぶんということとなりますでしょうか？ 同様に、 サンプルAとサンプルBのGAPDH発現量の差（上の例でいうと22-20=2サイクルぶんAで発現が多い）をGAPDHでの希釈系列から求めた検量線上で求めて、これはおおむね増殖効率良好で、2^2倍の濃度差であり、2サイクルぶんの濃度差であったとします。 それらを比較（引き算）することで、ΔΔCt値に増殖効率を補正したものとして、補正ΔΔCt値（仮にこう記載させていただきます）を計算（24+2=26） >2^補正ΔΔCt（2^26)を計算することで、何倍以上の発現があるかということを記載するということは、理論上受け入れられる方法となりますでしょうか？ a様 >そもそも検量線狭くないですか？ ご指摘の通りです、どうやら、3つでは希釈系列不十分なようですね。 まず常識を学ばねばなりませんね・・・・ありがとうございます。 今後は0.0001倍、0.00001倍の希釈系列も作成し5つでやってみるように致します。　御助言ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.4553-5 - 2015/11/05 (木) 20:35:33 - a >サンプルCのcDNAを使用（１倍、０．１倍、０．０１倍） そもそも検量線狭くないですか？ もっと低濃度側も測定できるようにしてみてはどうでしょうか？ というより、３っつって良かったけ？ 普通5段階以上取ると思います。＞MIQE

(無題) 削除/引用 No.4553-4 - 2015/11/05 (木) 02:05:57 - おお ddCt値なので>15なら2^15倍です。 >○○の部分の数字は任意の数字を選んで良いのでしょうか？ そんな科学的根拠がないことがみとめられるでしょうか。 あなたが回したcycle数が35として、片方がCt値が20、もう一方が35cycleでもたちあがらずCt値が>35なら、internal controlのCtがまったく一緒の場合 ddCtは>(35-20) 要するにあなたの検出系の検出限界を基準にすればいいという提案です。 グラフにするならratioをとらないで、発現量を縦軸にすれば、発現してない(検出限界以下)は0としてグラフでNDと表記すればいいのではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.4553-3 - 2015/11/05 (木) 01:42:28 - AA おお様 早速の御助言ありがとうございます。 色々文献あたってみたのですが、なかなか該当するような図表がなく、困っておりました。 >○○の部分の数字は任意の数字を選んで良いのでしょうか？ （例えば、他の遺伝子Y、Zなどの発現が30倍、50倍などであれば、遺伝子Xについては>100などとしても不自然な感じはございませんでしょうか？） 一般的なところが分からず、申し訳ありません。 logの棒グラフでの記載を考えておりましたが、この場合だと、やはりTableにしてΔΔCt値の数字を並べた形で表記した方が望ましい感じでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.4553-2 - 2015/11/05 (木) 00:02:46 - おお ddCtでひょうきして、>15というふうにかくのはどうですか? かんじへんかんできずにすいません。

realtime PCRで相対発現評価。比較対象での発現が無い場合。　 削除/引用 No.4553-1 - 2015/11/04 (水) 15:53:59 - AA 実験初心者です。 リアルタイムPCRについて御教授いただきたく投稿させていただきました。 周囲に詳しい人がおらず、こちらで御質問させていただきました。 相対定量（E-Method法）で、cDNAサンプルA、ｃDNAサンプルBの２つのcDNA間で、遺伝子Xの発現について、相対比較を行うことが目的なのですが（サンプルAでの遺伝子Xの発現量を１とした時のサンプルBでの遺伝子Xの相対発現量を求めることが目的です）、スタンダードの希釈系列として遺伝子Xの発現があるとわかっているサンプルCのcDNAを使用（１倍、０．１倍、０．０１倍）し、リファレンス遺伝子としてGAPDHを利用しました。 Aに対するBにおける相対発現量の評価は、Bでの遺伝子X発現量（以下スタンダードから得た相対的な発現量）/BでのGAPDH発現量 ÷ Aでの遺伝子X発現量/AでのGAPDH発現量 として求めると理解していますが、サンプルAでの遺伝子Xの発現がゼロである場合、相対発現量は計算上∞となってしまい、どのように解釈（あるいは記載）すれば良いのか分からずにおります。 RT-PCRを行えば、サンプルAではバンドは出ず、サンプルBではバンドが出るという結果とはなるのですが、他の遺伝子についても、検討しており、この遺伝子XについてのみRT-PCRで表現するというのは、不自然に感じています。マイクロアレイ後の確認のためのPCRであり、できれば、相対発現量の比較で表現できる方が、 望ましいかと考えているのですが、この遺伝子Xについてのみ、相対発現量での表現ができず、困っています。こういった場合の対応策を御教授いただけませんでしょうか？

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