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(無題) 削除/引用 No.4601-13 - 2015/11/24 (火) 00:18:55 - 名無し SDS-PAGEはその移（易）動度が比較的よく蛋白質の分子量を反映し、かつ簡単なので汎用されてるというだけで、かならずしも理論値とおりの分子量にバンドがくるとは限らないです（なんらかの理由でゲル内の移動が遅れて、実際の分子量よりも大きい位置で止まる）。修飾などによる影響ももちろんですが、それとは別にアミノ酸の組成の偏り（強酸性あるいは強塩基性蛋白質）とか強い疎水性や特異な高次構造（アミロイド繊維構成成分）などに起因して理論値と大きく異なる位置にバンドがでることはありますし、SDSでも解離しにくい相互作用が分子内あるいは分子間にあってもそうしたことは起こりえます。糖鎖間の相互作用に起因してそうしたことが起きるという論文を昔みたことあります。

(無題) 削除/引用 No.4601-12 - 2015/11/20 (金) 14:14:38 - おお >[Re:10] 独り言さんは書きました : > 血漿の２５ｋDaのバンドがIgGではないことを祈ります。 > > なるほど、コントロールがいるかな。。。

(無題) 削除/引用 No.4601-11 - 2015/11/20 (金) 14:13:22 - おお >以上の結果、ならびに、他種でこのタンパクについて調べた論文では一量体と二量体と三量体の存在が知られていることを引用して、私が調べた動物種の血漿では二量体として存在するという考察をし、論文投稿しました。 これと同じアプローチでやればいいようなきがします。引用したその論文は SDSPAGEでのサイズで ２量体とか検出していますか？

(無題) 削除/引用 No.4601-10 - 2015/11/20 (金) 14:08:08 - 独り言 血漿の２５ｋDaのバンドがIgGではないことを祈ります。

(無題) 削除/引用 No.4601-9 - 2015/11/20 (金) 13:48:45 - おお discussionで可能性があるというのはありですね。ただし、糖修飾とか他の可能性も同時にdiscussionにいれないと納得してくれないと思います。検出された一番大きいサイズが３量体で、２量体もあり、リコンビナントではなぜモノマーででるのかも多量体を見ているのだとすると説明を要すると思います。

(無題) 削除/引用 No.4601-8 - 2015/11/20 (金) 13:16:16 - asan 二量体で存在することを証明する必要があるなら、それだけではまずいでしょうね。でもおそらく論文の一部のデータで単にレビューで突っ込まれただけという状況かなあと思います。レビューの意図によると思いますが「理論値と大きくずれるけどこれは同じものをみてるのか？」という趣旨のコメントならば（つまり抗体の特異性の疑問）、別でノックダウン・ノックアウト実験をしてちゃんと機能する（少なくとも特異的である）抗体であること示すとかすればいいんじゃないでしょうか？二量体云々に関しては勝手な推察で「二量体」と言い切るのが問題だとの指摘ならば、文献情報でそういう話があるので「強いダイマーの可能性があるが、詳細はわからない」ぐらいに文面を変更すればいい話なのかもしれません。 まあ、論文の根幹にかかわる議論だったらさすがにそれでは認められんでしょうね。同様にWBで上の方にバンドが見える文献があればよいんでしょうが自分で勝手に言ってるだけならせいぜい別の細胞でもいいからタグ付きを過剰発現して同一条件でも複合体らしきバンドが生じることを示すしかないかもしれまん。 糖鎖、リン酸化とかなら質量分析まで取らなくてもin vitroで酵素処理してバンドが消えるかぐらいはすぐみれますし。20kDa以下の小さいタンパクは修飾でSDSpageのバンドシフトしやすい印象があるので、修飾の可能性も結構あるんじゃないかと思います。

(無題) 削除/引用 No.4601-7 - 2015/11/18 (水) 15:23:24 - dfe 1. 糖鎖修飾の可能性（組織が違えば修飾も違う？）→　酵素処理で確認 2. 抗体の非特異的認識（組織が違えば非特異がでることもある）→　ノックアウト or ノックダウン 3. 多量体の確認→ Native PAGE 4. 尿素でかわりましたっけ？

(無題) 削除/引用 No.4601-6 - 2015/11/18 (水) 15:10:19 - おお >[Re:5] APさんは書きました : > >そこで、何かのタンパクで、ベータメルカプトエタノールを使い加熱しても二量体のままであるタンパクをご存じないでしょうか？ > > 例えあったとしても非常に特殊な例であって、そういう文献情報を引っ張ってくるだけじゃディフェンスできないでしょう。それを主張するつもりならそれなりの実験データを示さなきゃ。 そうなの。だから知っていてもこれって示したら余計にこじれそうでできないの。。。

(無題) 削除/引用 No.4601-5 - 2015/11/18 (水) 15:07:17 - AP >そこで、何かのタンパクで、ベータメルカプトエタノールを使い加熱しても二量体のままであるタンパクをご存じないでしょうか？ 例えあったとしても非常に特殊な例であって、そういう文献情報を引っ張ってくるだけじゃディフェンスできないでしょう。それを主張するつもりならそれなりの実験データを示さなきゃ。

(無題) 削除/引用 No.4601-4 - 2015/11/18 (水) 14:47:44 - H 中年さんのおっしゃる通りです。 それで論文を投稿しちゃったってのもすごいです。 さすがひろこさんです。

(無題) 削除/引用 No.4601-3 - 2015/11/18 (水) 14:46:36 - おお ごくまれに2量体などの複合体がSDSPAGEで見れるタンパク質がありますが、普通は見れないです。その様な見れるタンパク質でも、かなりが解離して単体のバンドがmajorなバンドになっていることがおおいです。 お示しの状況で2量体というのは無理だと思います。少なくともその2量体や多量体と思われるものから何らかの処理を施して解離してモノマーと思われるバンド(またはそれに相当するもの)を得る必要がありますが、すでにSDSPAGEで変性させて蛋白の構造を壊していることを考えれば、2量体などの可能性はかなり少ないといえます。ほかの可能性をもう少し探ってみた方がいいかとおもいます。糖鎖修飾とか。

(無題) 削除/引用 No.4601-2 - 2015/11/18 (水) 14:19:40 - 中年 sds-resistant dimerでGoogle検索すればいろいろ出てきます。 それはさておき、SDS-PAGE上のバンドを移動度のみを根拠に二量体であると言い切るのはいくらなんでも乱暴だと思います。

二量体のウエスタンブロット？ 削除/引用 No.4601-1 - 2015/11/18 (水) 14:11:17 - ひろこ よろしくお願いします。 ある分泌タンパクを検出するためのウエスタンブロットを実施しました。なお、このタンパクは、ヒトではよく研究されていますが、私の研究している動物種での研究は皆無です。 SDSページ用のサンプルは、ベータメルカプトエタノールを使い、加熱しました。 大腸菌に作らせたリコンビナントのタンパクのバンドが、12.5 kDaぐらいに出ました。 一方、その分泌タンパクを合成・分泌していると他種では報告されている、組織Aのホモジネートを泳動したレーンからは14 kDaぐらいのバンドが出ました。 またその分泌タンパクを合成・分泌していると他種では報告されている、組織Bのホモジネートを泳動したレーンからは20kDaぐらいのバンドが出ました。 血漿を泳動したレーンからは25kDaぐらいのバンドが出ました。 以上の結果、ならびに、他種でこのタンパクについて調べた論文では一量体と二量体と三量体の存在が知られていることを引用して、私が調べた動物種の血漿では二量体として存在するという考察をし、論文投稿しました。 これに対して、ベータメルカプトエタノールを使い加熱したのならば、すべてが一量体として存在するのではないかというコメントが来ました。そこで、何かのタンパクで、ベータメルカプトエタノールを使い加熱しても二量体のままであるタンパクをご存じないでしょうか？ ただし当方も、なぜこのような多様なバンドサイズになるのかよく判らない点もあります。特に組織Aでは糖鎖がついている可能性も考えられますが、組織Bではなぜこのような分子量の位置に来るのか判りません。 何か、御意見、御助言を教えていただけると大変にありがたいです。

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