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制限酵素処理なしクローニング トピック削除
No.4628-TOPIC - 2015/12/02 (水) 09:33:56 - み
ギブソンアッセンブリー、In fusion、Gene artなど制限酵素処理なしで相同配列を利用してDNAを繋げる方法でPCR産物をベクターにクローニングする場合、試薬会社から購入できるものの中で使用感が良いものはどれでしょうか?

特にインサート(クローニングしたい遺伝子)10-15kbとベクター(5kbくらい)を繋げたいと考えています。
 
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(無題) 削除/引用
No.4628-13 - 2015/12/22 (火) 23:30:52 - toto
monさん、
ええ、そうなんですが、今後、どちらを使ったほうがいいのかを知っておきたいので。Builderが5'ミスマッチにtolerantというのは、確かにメリットで、他のところで妙なエラーを起こさないのならこちらに一本化したいところです。今、キャンペーンでGibsonより安いですし。

(無題) 削除/引用
No.4628-12 - 2015/12/22 (火) 20:58:31 - mon
totoさん、そこまで検証しなくてもこういう事例がありましたと報告すれば良いと思いますよ。
もし、NEBからレスポンスがありサンプル・配列情報を渡しても良いなら、検証はNEBに任せれば良いのでは。

(無題) 削除/引用
No.4628-11 - 2015/12/22 (火) 13:16:05 - toto
monさん、ありがとうございます。そうですね、3フラグメントアッセンブリとはいえ、欠損は見たことがなかったので、気になりました。Gibsonと全く同じ条件で比較して、Builderで異常の多いのが確認されれば、NEBに言ってみようかと思います。

(無題) 削除/引用
No.4628-10 - 2015/12/22 (火) 07:19:01 - mon
totoさん、ご報告ありがとうございます。
私の場合は、100%(6/6)正しい配列のものが取れました。
totoさんの結果はNEBに報告した方が良いかも。

NEBuilder HiFiDNA 削除/引用
No.4628-9 - 2015/12/21 (月) 22:01:22 - toto
随分下に行ってしまったのであげます。ここに書いた、NEBのGibsonAssemblyの後継とされているNEBuilderをいくつかのコンストラクトで使った結果です。1Kbの異なるフラグメントAとBをoverlapを20bpつけてDNA合成して、A+Bをベクターに入れるというコンストラクションで、合成DNAの2つを(PCRなしに)消化したベクターと混ぜた場合、いずれのコロニーも正しくつながってはいました。が、insertの中に1-2塩基の欠損のあるものが3割、変異のあるものが4割もありました。正しいORFのものが取れて入るから良いですが、合成DNAのミスは滅多に遭遇せず、Gibsonで同じようなコンストラクションすると変異も欠損もまず出ないので、がっかりでした。

別の0.5Kと1Kの合成DNAフラグメントを同時にベクターに入れるというのNEBuilderでやったところ、なぜか正しくつながったものがとれず、結局、それぞれをPCRで揃えて、GibsonAssemblyでやり直したら、100%正しい配列のがとれました。PCRしたものををBuilderでやればどうなるかはわかりませんが、BuilderはほんとうにGibsonの改良版なのかという気がしてきました。たまたまなのかはわからないのですが、他に使われた方がおられたら、結果を教えてください。

(無題) 削除/引用
No.4628-8 - 2015/12/04 (金) 17:36:01 - み
momさん、totoさん
ありがとうございます。

NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kitは知りませんでした。
これが一番良さ気ですね。
すでに旧Gibson assembly kitを発注してしまっていて納品されてしまうました。。。
金欠なのでしばらくこれで頑張ってみます。

(無題) 削除/引用
No.4628-7 - 2015/12/03 (木) 21:47:18 - toto
monさんの紹介された、このNEBの新しいのはよさげですね。5', 3' mismatchを除いてくれるのが合成DNAをつなぐときに便利そうです。1Kの5本のDNAフラグメントとベクターを、つまり6本を同時に11/12の確率でつないでくれるというのがほんとなら、すごい。ただ、この名前はなんとかならないものかと思いますが。早速買ってみます。

(無題) 削除/引用
No.4628-6 - 2015/12/03 (木) 20:16:42 - mon
NEBはギブソンアッセンブリーの後継として、NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kitを押してますね。
同じDNAで比較したわけではないのですが、Infusionより効率は良いような気がします。
(Manualの1/5量=total 4uLで使っています。)

(無題) 削除/引用
No.4628-5 - 2015/12/03 (木) 19:50:28 - み
totoさんコメント有難うございます。
gibson良さ気ですね。

調べていたら以下のようなものもありました。

Thermo社 GeneArt High-Order Genetic assembly system
GeneArt Seamless PLUS cloning and Assembly kit

(無題) 削除/引用
No.4628-4 - 2015/12/03 (木) 10:39:42 - toto
InFusionからGibsonに乗り換えたのは、MPさんの書かれたように効率の高さです。subcloningではあり得ないくらい大量のコロニーが生えてほぼ全勝です。また、組成も、これの原報のラボで公開されているので、自分で作ることもできて、全くブラックボックスなInFusionより、気持ち的に安心できます。またオーバーラップ部分の長さを20-25merにできるせいなのか、15merと指定されてるInFusionよりおかしなつなぎ方になる頻度が減ります。メーカー推奨の1/4の反応スケールでやってるので、とても安くできてます。InFusionも悪くないのですが。
 
Gibsonで4Kbのインサートをベクターにつないだことありますが、普通にできました。というか、ベクターの長さが普通はそれくらいなので、4Kくらいならできるはずと思いますが。ただ、みさんの質問のような10-15kbとなると、さすがにどうでしょうか。オーバーラップ配列に相同な部分がその中になければできるのかもしれませんが。結果を知りたいところです。

(無題) 削除/引用
No.4628-3 - 2015/12/03 (木) 09:44:46 - み
>[Re:2] MPさんは書きました :
> ギブソンに1票。
> in fusionより明らかに効率がよい。コストに関してはわかりません。

有難うございます。
Takara社の営業マンに聞いたところIn fusion(Takara製品)でもgibson(NEB製品)でもせいぜい2kb断片を繋ぎあわせるのがやっとだとか言っていましたがどうなのでしょうか?

NEB Web pageでのgibson製品の説明では5kbでも可能なデータが記載されています。

価格もgibsonが安いです。In fusionもまあまあ安い。

(無題) 削除/引用
No.4628-2 - 2015/12/03 (木) 08:55:44 - MP
ギブソンに1票。
in fusionより明らかに効率がよい。コストに関してはわかりません。

制限酵素処理なしクローニング 削除/引用
No.4628-1 - 2015/12/02 (水) 09:33:56 - み
ギブソンアッセンブリー、In fusion、Gene artなど制限酵素処理なしで相同配列を利用してDNAを繋げる方法でPCR産物をベクターにクローニングする場合、試薬会社から購入できるものの中で使用感が良いものはどれでしょうか?

特にインサート(クローニングしたい遺伝子)10-15kbとベクター(5kbくらい)を繋げたいと考えています。

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