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(無題) 削除/引用 No.4635-13 - 2015/12/17 (木) 15:06:34 - IF みなさま ご教示いただいた下記の改善点により，ノンスペが減りました． １．固定：風乾をやめて４％PFAで１時間固定 ２．２次抗体の目的細胞による吸収処理．この処理で２次抗体だけでのノンスペ蛍光がほぼ抑えられました． ありがとうございました． ただ，コントロールのアイソタイプ１次抗体（ウサギ）＋２次抗体でも若干の蛍光を検出してしまいます．テストの１次抗体（ウサギ）＋２次抗体もしっかり蛍光は検出でき，随分とよくなりましたが． アブカムのIFプロトコールに，コントロールは２次抗体だけと反応させたもの，つまりアイソタイプ１次抗体処理をしないという方法が記載されていましたが，実験として違和感があります．これってノンスペが無いことの証明実験でOKでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.4635-12 - 2015/12/08 (火) 13:09:46 - IF APさん； ありがとうございます． 私の実験の場合は，2次抗体を，あらかじめ滑膜細胞で前処理（吸収）した後に，その2次抗体を本番で使用したらどうか？ということでしょうか？ ご教示いただいた方法はあまり意識しておりませんでした． ありがとうございます．

(無題) 削除/引用 No.4635-11 - 2015/12/07 (月) 23:12:50 - AP 2次抗体がWhole IgということなFcを含むので、標的組織がFcレセプターを持っている場合(Fcを発現している、ではないです)、くっつきます。 なんか、伝わってないなあ。

(無題) 削除/引用 No.4635-10 - 2015/12/07 (月) 23:06:59 - AP >ありがとうございます．2次抗体はFabを認識するポリクロ抗体で，吸収処理済でした．今確認しました． その吸収処理は、他種Igに対してのことではないですか。二次抗体では普通の処理です。 ではなくて、標的標本自体に反応する抗体種を除くために、標的組織で前吸収したらいいということなのですが。

(無題) 削除/引用 No.4635-9 - 2015/12/07 (月) 19:15:19 - IF APさん； ありがとうございます．2次抗体はFabを認識するポリクロ抗体で，吸収処理済でした．今確認しました． 関節の滑膜線維芽細胞を実験に利用していますので，Fcの発現は無いと思います． 固定方法と自家蛍光について，こちらでも確認してみます． 独り言さん； ありがとうございます．風乾ダメなんですね． 張り付き細胞の洗いは，次回からPBSかTBSTを使ってみます．ウェットな状態から0.4%PHAで固定をして，染色をしてみます． 調整がうまくいかなかった場合，また相談させてください．

(無題) 削除/引用 No.4635-8 - 2015/12/05 (土) 19:03:27 - 独り言 培養細胞は普通、風乾かせることはまずやらないです。蛍光染色ならむしろやってはいけないはずです。組織切片とはまったく異なり、構造を保つような処理なんてなにもしてないんだし。 ましてやDMEMでwashしたあとに風乾させたらDMEMの成分が結晶化するでしょうし。 乾燥して、自家蛍光がでてしまっているような気がする。

(無題) 削除/引用 No.4635-7 - 2015/12/05 (土) 13:16:13 - AP >Alexa Furo 488 anti-mouse Fab antibody 抗マウスIg抗体のFab断片ということですよね。 マウスIg Fab断片に対する抗体ということではなくて、 それはポリクロですかモノクロですか。 ポリクロであれば前吸収するのがいいと思います。 対象となる組織・細胞をそのまま、あるいは固定したものをアセトンパウダーにしたものがよく使われます。 二次抗体がFabなんであれば関係ないですが、対象細胞がFcレセプターを持っているとIgのFcドメインで非特異的に染まることがあります。 また、Igはコラーゲンなど塩基性の強いタンパク質に非特異的にくっつくので、非特異的な染色の原因になることがあります。 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3216515/ 自家蛍光かどうかは免染なしで見てみればすぐ確かめられますね。 コラーゲンやエラスチンは自家蛍光が問題になることがあります。 アルデヒド固定による自家蛍光は、フォルムアルデヒドよりグルタルアルデヒドのほうが問題になることが多いようです。アルデヒドによる自家蛍光は鈍い黄色で緑にはかぶらないので適当なフィルターを使えば区別できるといいます。 アルデヒド固定した標本をアルデヒドブロックしたほうがいいのは、フリーのアルデヒドグループが抗体などを標本上に固定してしまうことがあるからです。

(無題) 削除/引用 No.4635-6 - 2015/12/05 (土) 09:18:07 - IF みなさん．ありがとうございました． コメントを読んで，いくつか思い当たる節ありましたので，調整してみます． また，上手くいなかい場合は，意見を求めさせてください．

(無題) 削除/引用 No.4635-5 - 2015/12/05 (土) 02:06:42 - おお ん、4% PHA。。。タイプミスかな。 自家蛍光なら固定方法を変えるというのもてかと。そうでなくてもやってみる価値はあるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.4635-4 - 2015/12/05 (土) 01:54:00 - あqswでfrgtyふ とりあえず考えた事書くから。 1. 今の２次抗体があれなら別のものに変えてみる。これがとりあえず一番かと。 2. 自家蛍光っぽいならば蛍光標識の種類を変えてみる。 3. もしPFAで固定してるならば、そのあとglycine bufferなど等のアミノ基もつものでアルデヒドをブロッキングする。アルデヒドに由来する構造が自家蛍光の原因になるので---みたいな話を読んだことがある。 4. バックが高いことはしょうがないと割り切って、controlとの差し引きで本当のシグナルを識別する。 5.オートとかの設定だと、もともとの１次抗体の反応が弱すぎる時、その弱いシグナルを見せようとして顕微鏡が自動で勝手に全体のシグナルを増強して、本来なら見えなくていいものまで見えてしまっているとかもあるかも。設定を一応確認したらどうかな。

(無題) 削除/引用 No.4635-3 - 2015/12/04 (金) 13:17:27 - たていす > ブロッキングはマウス血清，BSA，skim milkなど濃度を振って検討しました． ブロッキングで１次抗体と同じ動物（マウス）の血清を使っているようですが、これでは、ブロックしたところが全て二次抗体で検出されてしまいます。 ブロッキングには「二次抗体と同じ動物（ヤギかなぁ？）の血清」を使います。

(無題) 削除/引用 No.4635-2 - 2015/12/04 (金) 12:51:13 - おお 風乾の必要があるかどうかわかりませんが、、、自家蛍光の可能性については調べましたでしょうか。

細胞蛍光抗体染色のコントロール 削除/引用 No.4635-1 - 2015/12/04 (金) 12:39:47 - IF タンパクの細胞内局在を確認するため，蛍光標識抗体を用いた細胞染色実験の調整中です． Negative controlとして1次抗体にisotype-mouse IgGを使用し，2次抗体はAlexa Furo 488 anti-mouse Fab antibodyを利用しています．関節リウマチの滑膜細胞を利用して実験していますが，2次抗体だけでもノンスペが強いため，困っています． サンプルは，Chamber付のスライドグラスで滑膜細胞を培養し，培養液除去，DMEMで洗った後，細胞を風乾させ準備しています．固定は4% PHA，ブロッキングはマウス血清，BSA，skim milkなど濃度を振って検討しました．ブロッキング時間はover night，1時間など振っています．どのブロッキング条件でもノンスペが出ます． どうしたものでしょうか？？ご意見よろしくお願いいたします．

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