全12件 ( 1 〜 12 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.4679-12 - 2015/12/24 (木) 13:22:12 - もも チャンバーの使い方、ありがとうございました。 たしかにフィルターについては種類が異なると思われますので、今一度確認したいと思います！

(無題) 削除/引用 No.4679-11 - 2015/12/23 (水) 08:27:19 - fa 蛍光色素の選定で大切なことは、実際使用する機器に搭載されているフィルターを確認することです。 候補として、TRITCとAlexa647を挙げていますが同じフィルターでは観察できません。 それぞれに対応するフィルターがあるのであればよいのですが、TRITCだとするとAlexa546, 555あたりになります。 まずはフィルターを確認してください。 蛍光色素は好みがあると思いますが、FITCやTRITCは蛍光強度および寿命の点で最近の蛍光色素に及ばないので、個人的には使いません。なぜFITC固定かわかりませんが、他に選択肢があるなら避けた方がよいと思います。 Alexa系は強度・寿命とも優れているので現在広く使用されていますが、DyLightやCF DyeなどはAlexaより優れているとうたってはいます。Cy系色素は明るいですが、若干寿命に難がある印象です。 今後、様々なタンパク質を検出する予定があるなら、標識一次抗体ではなく標識していない一次抗体と標識二次抗体の組み合わせの方が汎用性が高まるし、感度も上げることができます。なにより選択の幅が広がります。 あと、チャンバースライドを使用しているということですが、最初にチャンバーをはずして組織の染色の様に行う方法と、チャンバーを残して溶液を入れて捨てる方法があります。私は後者でやってます。

(無題) 削除/引用 No.4679-10 - 2015/12/22 (火) 21:29:02 - もも ありがとうございます。 BSA等については見積もり依頼し、和光さんの分で早速注文しました。 もう一つ教えていただきたいことがあります。 他の検討で二重染色をする予定です。conjugateされた抗体を買う予定なのですが、一方の抗体はFITC-conjugateで確定です。もう一方の抗体はAlexa flour 647-とTRITC-の２つの候補があるのですが、最終的に得られる色以外に、退色や輝度、使われる頻度、お勧めの方、など違いがございましたら教えてください。

(無題) 削除/引用 No.4679-9 - 2015/12/21 (月) 12:39:00 - おお BSAはFraction Vと書かれているものでエタノールなど有機溶媒を精製で使っているものでいいかとおもいます。有機溶媒を通しているのは脱脂ができていると思っています。ヒートショックとかいろいろ精製の過程でやっているものもありますけどその辺りは詳しく解説できません。ただ有機溶媒や熱を通して夾雑するヌクレアーゼやプロテアーゼの失活は期待できるかと。また分子生物学用試薬としてアセチル化された BSAが売ってたりしますけど、抗体などのブロッキングには普通は使わないかとおもってます。 TX１００はどこでもいいかと思いますけどね。日本だとナカライとかで売ってませんか？

(無題) 削除/引用 No.4679-8 - 2015/12/21 (月) 09:54:13 - fa RhoAの染色にTCAがよいということですが、抗体によっては4%FAでも染まるようです。 doi:10.1016/j.yexcr.2004.01.005 TCAを使う場合は、tubulinがTCA固定で染色できるかを確認する必要はあるでしょう。 ひとまず、手持ちの抗体に適した固定法を探すべきです。 一般的なのは、FA, PFA, or GA + permeabilization (0.1-0.2% Triton X100）もしくはcold methanolなどがあります。 単染色でそれぞれの条件で染色が可能かを確認してみたほうがよいと思います。 ブロッキングは細胞だけではなく、培養しているプレートへの抗体の吸着も抑制する意図があります。BSAでも血清でも構いません。抗体希釈液へは一応添加していますが、私自身でブロッキング剤の有無で比較したことはないです。TOYOBOから抗体希釈用の溶液があるので、感度が低ければ使ってみるとよいかもしれません。BSAはいろいろ種類がありますが、一般的にはCohn Fraction V (pH7)をブロッキングに使用すると理解しています（違っていたらすみません）。 国内であれば、和光純薬やナカライテスクの方がシグマより安価なことが多いです。出入り業者によっても値引率が違うので、一度見積もりを依頼してみたほうがよいでしょう。 ラボの方針によると思いますが、どこのメーカーでも品質は問題ありません。

(無題) 削除/引用 No.4679-7 - 2015/12/20 (日) 14:45:57 - もも URLありがとうございます。 プロトコルに関して、自分の考えたものと比較しました。 ブロッキング剤や界面活性剤の購入を考えているのですが、どのメーカーのものを利用すればいいのでしょうか？ 今のところ、シグマのtriton X-100、BSAを考えています。 色々なメーカーが販売しているようですが、お勧めのメーカー等ございましたら教えてください。

(無題) 削除/引用 No.4679-6 - 2015/12/18 (金) 02:10:12 - おお http://www.abcam.com/alpha-tubulin-antibody-dm1a-microtubule-marker-fitc-ab64503.html 真ん中からちょっとしたあたりに CC/IF image of ab64503 stained human HeLa cells. The cells were methanol fixed (10 min), permabilised in 0.1% PBS-Tween (20 min) and incubated with the antibody (ab64503, 1µg/ml, FITC conjugated (green)) for 1h at room temperature. 1% BSA / 10% normal goat serum / 0.3M glycine was used to block non-specific protein-protein interactions. Alexa Fluor® 594 WGA was used to label plasma membranes (red). DAPI was used to stain the cell nuclei (blue).

(無題) 削除/引用 No.4679-5 - 2015/12/18 (金) 00:57:24 - おお 抗体が非特異的に細胞のタンパク質に吸着されてしまえばバックグランドになりますよね。またFc receptorなどと抗体がinteractionするとそれも関係ないシグナルを見ていることになります。Fc receptorとかのブロックは血清などを使う方がいいです。 なにか推奨プロとコールなど見つからないでしょうか?

(無題) 削除/引用 No.4679-4 - 2015/12/17 (木) 22:18:47 - もも 早速のご回答ありがとうございます。 ご指摘のとおり、省略できるところも多々あると思いますので、実際に抗体や試薬を購入後、染色時間や希釈倍率などとともに検討したいと思います。 ○細胞をスライドからはがす。これについては表現を誤りました。チャンバースライドからチャンバーをはがすという意味です。失礼しました。 複数の１次抗体や２次抗体を使用し宿主等が複数の動物種となる場合は、おそらくブロッキングが必要となるかと思いますが、本検討においてもブロッキングは必要なのでしょうか？「ブロッキングは抗体を希釈する溶液にBSAや血清(goatなど）をくわえることが多いかと思います。」という方法論については初めて知りました。 また、各種抗体については文献に詳しく書かれているため（たとえばシグマやsanta cruzなど）使用頻度が高い抗体を利用しようと思うのですが、triton XやBSAについてはどこを探しても、「ブロッキングした」「triton Xを通して」など具体的な製造業者、製造番号などが書かれていませんでした。もしよろしければ、BSAとtriton Xについて一般的に使われるもの、あるいは今現在使用しているものを教えていただければと思います。

(無題) 削除/引用 No.4679-3 - 2015/12/17 (木) 22:01:45 - おお ○細胞をスライドからはがす。 この操作がよくわかりませんでした 個人的にはこの手のことは余りやらないので、他の人の意見も待ってみてください。

(無題) 削除/引用 No.4679-2 - 2015/12/17 (木) 22:00:09 - おお TCAは余りやらないのでよくわからないですが、、、triton x-100は細胞膜の脂質と相互作用して穴を開けて細胞内への抗体の透過性を上げるのによく使います（特にPFA固定の時）。TCAではクロスリンクされていないので、どうだろう一部流れ出るかなぁ。。。TCAで蛋白は凝集するので、抗体がアクセスしにくくなっているかもしれませんので、抗原の賦活性と言った作用もあるかもしれませんが、想像で適当に言ってます。ブロッキングは抗体を希釈する溶液にBSAや血清(goatなど）をくわえることが多いかと思います。 �EMouse monoclonal anti-RhoA-TRITC：PBSで希釈して使用 �GMouse monoclonal anti-α-Tubulin−FITC：PBSで希釈して使用 �Eと�Gを混液でやって単独と遜色がないならステップが減られすと思います。DAPIも一緒に加えておくと更にステップがはし寄れるでしょう。 �C0.2%triton X-100 　5-15分（4℃） �DPBS　5分×3回 �Dの洗浄はあまり神経質になる必要もないと思いますけど。 相当はし寄れるところを指摘しましたが、一応はしよって遜色がないかは確認しながら進めていったほうがいいかもしれません。

細胞骨格と細胞分裂関連タンパクの蛍光染色 削除/引用 No.4679-1 - 2015/12/17 (木) 21:32:38 - もも お世話になります。 大学院へ進学し、培養細胞を用いて実験を行っております。 蛍光染色はこれまでに何度か行ったことがありますが、研究室では培養自体が先駆けであり、これまでに行ったことは核染くらいです。 このほど、HeLa細胞やNIH3T3細胞について細胞骨格（α-tubulin）や細胞分裂関連タンパク（RhoA等）を染める必要があり、一からプロトコルを作成しています。 以下、一般的な染色の流れとして、プロトコルに足りないところや修正したほうがいいところがございましたら、ご指摘いただければ幸いです。なお、時間や希釈倍率等は検討中です。 ○細胞をスライドからはがす。 �@PBS（37℃）　5分×3回 �A10％TCAで固定　15分（4℃）→RhoAはTCA推奨とのこと。 �BPBS　5分×3回 �C0.2%triton X-100 　5-15分（4℃） �DPBS　5分×3回 �EMouse monoclonal anti-RhoA-TRITC：PBSで希釈して使用 �FPBS　5分×3回 �GMouse monoclonal anti-α-Tubulin−FITC：PBSで希釈して使用 �HPBS　5分×3回 �IDAPI：PBSで希釈して使用　室温15分 �J封入 �Kシーリング なお、triton Xは界面活性作用があるとのことですが、これは細胞膜の透過性(?)をよくして、浮遊しているtubulinを排除する(?)という理解でいいのでしょうか？さらに、ブロッキングの必要性についても理解に苦しむところです。あまりに基本的な質問で恐れ入りますが、あわせてご教授願います。

全12件 ( 1 〜 12 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---