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(無題) 削除/引用 No.4687-16 - 2015/12/21 (月) 15:27:59 - molecule >プライマーは共通していて、長さが違うバンドが出るようになっているのでしょ>うか、それともWT用、Mutant用のプライマーセットを混ぜてやっているので>しょうか。 >もし後者だけならWT用だけ、Mutant用だけでPCRかけたらどうなりますか？万が>一ノンスペがでているなら、WTだけでもMutantのバンドが出たりとかおもった>り。。。 後者のWT用、Mutant用のプライマーセットを混ぜてPCRをかけています。 別々で一度かけてみます。

(無題) 削除/引用 No.4687-15 - 2015/12/21 (月) 15:22:14 - おお まあサザンはなるべく早くにやってしまったほうがいいかもしれませんね。結果の解釈がし易いし。

(無題) 削除/引用 No.4687-14 - 2015/12/21 (月) 15:21:01 - おお プライマーは共通していて、長さが違うバンドが出るようになっているのでしょうか、それともWT用、Mutant用のプライマーセットを混ぜてやっているのでしょうか。 もし後者だけならWT用だけ、Mutant用だけでPCRかけたらどうなりますか？万が一ノンスペがでているなら、WTだけでもMutantのバンドが出たりとかおもったり。。。 ばんど切り出して配列確かめたりとかいうのもやったほうがいいのかな。

(無題) 削除/引用 No.4687-13 - 2015/12/21 (月) 14:55:12 - 独り言 >[Re:10] みさんは書きました : > >[Re:9] moleculeさんは書きました : > > >親マウスのDNAを複数回取り直してPCRしたのでしょうか。 > > コンタミしたDNAをtemplateにして何回PCRかけても同じ結果になるのは当たり前だし。 > > 産仔数が２，３匹とか極端に少なくなければ胎生致死になっている可能性も考えなくて良いでしょう。 > > > > 親マウスのDNAは1度だけ取り、一度しかPCRを行っていません。 > > > > > 数ケージやっていてもWTxKOってことを否定しておかないとね。 > 親の世代のGenotypingから問題はなかったのかな。 > 親組織片を回収しなおすのと、同時にコントロールとして動物屋からWTを１匹購入して、DNA調製試薬とPCR試薬を全て新調して解析し直すとか。 > まあ以前に採ったDNAでWT/KOが出ているようだからPCR試薬は大丈夫だと思うけど、DNA調製試薬（皆が言うProKなど）のコンタミは否定されていないのかな。 そうか。親マウスが実はヘテロじゃなくて、間違えているんじゃないかな。私も昔、親のジェノタイプを間違えてしまったことはありました。 でもヘテロしか生まれてこないっていることは、WTとKOを掛け合わせているということになってしまうのかな。

(無題) 削除/引用 No.4687-12 - 2015/12/21 (月) 14:27:28 - MP 系統維持は兄妹同士の掛け合わせでやってるのでしょうか？だとすると何かおかしなことが起こっている可能性も否定はできないかも、といっても説明はできないですけど。いちどまともなB6を購入して子を得て、そのヘテロ同士の交配をしてみては？

(無題) 削除/引用 No.4687-11 - 2015/12/21 (月) 13:29:36 - molecule >数ケージやっていてもWTxKOってことを否定しておかないとね。 親の世代のGenotypingから問題はなかったのかな。 親組織片を回収しなおすのと、同時にコントロールとして動物屋からWTを１匹購入して、DNA調製試薬とPCR試薬を全て新調して解析し直すとか。 まあ以前に採ったDNAでWT/KOが出ているようだからPCR試薬は大丈夫だと思うけど、DNA調製試薬（皆が言うProKなど）のコンタミは否定されていないのかな。 DNA調製試薬のコンタミは否定できていません。 操作手順を考えますと、DNA調製試薬に対するコンタミの可能性はまずありえないと考えていたのでノーチェックでした。 しかしながらProKは研究室で共用のものを用いているので、予期せぬことが起きているかもしれません..、ProKを新調し親世代の組織片から改めてチェックしたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.4687-10 - 2015/12/21 (月) 13:09:27 - み >[Re:9] moleculeさんは書きました : > >親マウスのDNAを複数回取り直してPCRしたのでしょうか。 > コンタミしたDNAをtemplateにして何回PCRかけても同じ結果になるのは当たり前だし。 > 産仔数が２，３匹とか極端に少なくなければ胎生致死になっている可能性も考えなくて良いでしょう。 > > 親マウスのDNAは1度だけ取り、一度しかPCRを行っていません。 > 数ケージやっていてもWTxKOってことを否定しておかないとね。 親の世代のGenotypingから問題はなかったのかな。 親組織片を回収しなおすのと、同時にコントロールとして動物屋からWTを１匹購入して、DNA調製試薬とPCR試薬を全て新調して解析し直すとか。 まあ以前に採ったDNAでWT/KOが出ているようだからPCR試薬は大丈夫だと思うけど、DNA調製試薬（皆が言うProKなど）のコンタミは否定されていないのかな。

(無題) 削除/引用 No.4687-9 - 2015/12/21 (月) 11:37:42 - molecule >親マウスのDNAを複数回取り直してPCRしたのでしょうか。 コンタミしたDNAをtemplateにして何回PCRかけても同じ結果になるのは当たり前だし。 産仔数が２，３匹とか極端に少なくなければ胎生致死になっている可能性も考えなくて良いでしょう。 親マウスのDNAは1度だけ取り、一度しかPCRを行っていません。 産仔数は8~10程度です。 補足ですが、数ケージで繁殖を行っていて、すべてのケージで同様にヘテロが産まれてきています。

(無題) 削除/引用 No.4687-8 - 2015/12/21 (月) 11:27:06 - み 親マウスのDNAを複数回取り直してPCRしたのでしょうか。 コンタミしたDNAをtemplateにして何回PCRかけても同じ結果になるのは当たり前だし。 産仔数が２，３匹とか極端に少なくなければ胎生致死になっている可能性も考えなくて良いでしょう。

(無題) 削除/引用 No.4687-7 - 2015/12/21 (月) 11:01:08 - molecule >その-/-がマウスの成育にほぼ正常におきるのであれば、確率的におかしなかことですね。 普通に考えるとPCRになにか原因があるようにしか思えない。もしくはマウスのバックグランドが変わったりしてませんか？ずっとB6とかですか？ マウスのバックグラウンドはB6で統一されています。 もしくは他にサザンならWBなりで一度１０匹ぐらい確かめてみるといいかもですね。 他の手法を用いたチェックですね、そちらも検討してみます。

(無題) 削除/引用 No.4687-5 - 2015/12/21 (月) 10:00:43 - 独り言 その-/-がマウスの成育にほぼ正常におきるのであれば、確率的におかしなかことですね。 普通に考えるとPCRになにか原因があるようにしか思えない。もしくはマウスのバックグランドが変わったりしてませんか？ずっとB6とかですか？ もしくは他にサザンならWBなりで一度１０匹ぐらい確かめてみるといいかもですね。

(無題) 削除/引用 No.4687-4 - 2015/12/21 (月) 09:21:54 - molecule >その可能性はありますが、それ以外にですとゲノム抽出試薬がコンタミしている可能性もあり得ます。一度ProKなり新しくしてみてください。 >抽出試薬のコンタミだったらサンプルの代わりに水とか加えて操作したものをpcrにかけるといいかもしれません。 抽出試薬はチェックしたのですがProKへのコンタミは考えていませんでした、ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.4687-3 - 2015/12/21 (月) 08:09:03 - おお 抽出試薬のコンタミだったらサンプルの代わりに水とか加えて操作したものをpcrにかけるといいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.4687-2 - 2015/12/21 (月) 01:16:37 - ゆん 代々研究室に受け継がれてきたマウスなので、数年間にわたる交配が続き+/-でなければ生存できない変異が入ってしまったのでしょうか...。 その可能性はありますが、それ以外にですとゲノム抽出試薬がコンタミしている可能性もあり得ます。一度ProKなり新しくしてみてください。

ヘテロマウス同士をかけ合わせてもヘテロマウスしか産まれない 削除/引用 No.4687-1 - 2015/12/20 (日) 20:35:57 - molecule ある遺伝子について、ヘテロの母とヘテロの父マウスをかけあわせても、ここ数ヶ月ヘテロのみしか産まれないという状況が起きてしまっています。 +/+と-/-は一匹も産まれてこず、+/-のみが産まれてきます、ホモのノックアウトがlethalであったり、数週齢で死ぬということもないマウスなので困っています。 上記マウスの遺伝子型をPCRによって確認する際には、以前取れていた+/+、-/-マウスのDNAをPCRのcontrolとして同時にpcrにかけていますが、やはりそれらはきれいに+/+、-/-のバンドが出てきます。 代々研究室に受け継がれてきたマウスなので、数年間にわたる交配が続き+/-でなければ生存できない変異が入ってしまったのでしょうか...。 皆様のご意見をお伺いしたいです、よろしくお願い致します。

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