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(無題) 削除/引用 No.4727-6 - 2016/01/08 (金) 22:28:00 - BS 詳細にご説明くださりありがとうございます。 まずは、おっしゃるように、｢塩濃度｣と｢tris濃度｣を混同してしまっていました。 確かに、希釈したlane marker(4-5倍希釈用）に終濃度50mMとなるようにDTTを入れたもので蛋白の溶出をおこなうというのも、そのまま泳動に持っていくシンプルな方法と理解できました。 おおさん、独り言さん、拙い質問にもかかわらず丁寧にアドバイスくださり本当にありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.4727-5 - 2016/01/08 (金) 06:20:59 - おお わたしも2xぐらいの濃度になっても気にしないくちですが、タンパク溶出そのlane marker(1x)+DTTでやってしまえばいいんじゃないでしょうか?組成はほとんど変わらないですし。 塩はどこにも入ってないですし、そもそもTris bufferでえられたlysateにsample bufferなりお示しのlane markerなりを加えて電気えいどうするのがたいていですからあまりTrisは気にしなくてもいいかとはおもいますけど。

(無題) 削除/引用 No.4727-4 - 2016/01/08 (金) 05:16:19 - 独り言 SDS もDTTも濃い分には問題ないです。２xや３xのsample bufferの濃度で泳動することもよくやりますが、全く問題ないです。 膜分画を取るときのバッファーに塩が入っている気がしますが、入っていないのでしょうか？どちらにしてもLamuiとかそのlane markerとやらに塩が入っていないでしょうから、塩濃度を最後にさらにあげる必要はどこにもないと思いますが。塩濃度がいくらというよりも、サンプル間でそろっているほうが大事。 そもそもTrisと塩濃度を一緒に考えてしまっているような気がしますが大丈夫でしょうか？

(無題) 削除/引用 No.4727-3 - 2016/01/08 (金) 03:28:58 - BS ご意見ありがとうございます。 ｢マーカー｣は分子量マーカーではなく、泳動確認のためのtracking dyeのことです。説明が不十分で申し訳ございませんでした。 ちなみに、Roti-load 1とThermoのカタログ39001（還元剤なし）のピンク色の試薬が研究室にあります。 おおさんがおっしゃるように、以前本でサンプルのtris塩濃度は高くなるとシャープなバンドがでにくく、100mM以下が望ましいと読んだことがあったのも気になっていたのもあります。

(無題) 削除/引用 No.4727-2 - 2016/01/08 (金) 03:00:48 - おお サンプルとマーカーを混ぜるのですか?混ぜないならマーカーはそのまま流せるタイプが多いと思いますが。。。お示しのマーカーのカタログ番号とか示していただけませんか? 普通はマーカーは個別のレーンに流しますので、お示しのような調整はしませんけど。混ぜるとしたら何か特別な事情があるのですか? SDSPAGEのほうは、還元剤なしでやることもありその量がエイどうの状態に影響することはかじょうにくわえないかぎりほとんどないです。いちど処理してSS結合が外れてしまえば変性状態というのも手伝って元に戻ることはほとんどありません。おそらくDTTや2MEなどはゲルに入らないんじゃないかと。入ったっとしてもまんべんなくレーンのどの高さににも存在することはないでしょう。 DTTは濃度で100mMぐらいまでやったことがありますがそんなに影響があったきおくがありません。 SDSも1~2%ならまず大丈夫だと思います。塩濃度は100mMぐらいまでなら良好ですが、多くなるに連れて移動度が遅くなる傾向にありますとくに200とかさらにあげていくと。ものによっては若干バンドがシャープにならいってこともあるかもしれません。ただし、各レーンでそれぞれの濃度が違うと、あるレーンは横に広がり、またあるレーンはしぼんだように細くなったりというのはあります。混ぜてしまうのなら、そのレーンでは塩濃度もsdsもDTTも一緒なのでそんなに気にすることはないです。 Tricineゲルは塩濃度の影響を受けにくいです。

SDS-PAGE sample の調整について 削除/引用 No.4727-1 - 2016/01/08 (金) 01:54:14 - BS 質問させていただきます。 培養細胞の表面蛋白をビオチン化した後、アビジンアガロースで膜画分を回収し、回収した蛋白をSDS-PAGE→immunoblotという実験系を計画しています。 アビジンに吸着させたビオチン化タンパクからタンパクを溶出するのにSDS-sample buffer（trisなど還元剤以外の濃度はLeammeliに準じています) + 50mMDTTを使用する予定なのですが、ここからの泳動サンプル調整過程で疑問があります。 このサンプルにマーカーをつけるため、RotiloadかThermoのLame markerを4-5倍程度希釈として混合しようと思いますが、これらはマーカーの他に濃縮された還元剤、Tris、Glycerin, SDSを含むために、SDS sample bufferのサンプルと混合するとLeammeliよりも組成が、2倍（2×Sample buffer）程度に高くなってしまい、塩濃度などをどこまで調整すべきかで悩んでいます。 ビオチンのSS結合解離にはSDS、DTT濃度が重要なので、塩濃度などについては10mM程度にあらかじめ低めに調整しておいて、マーカー今後の最終濃度がleammeliの組成に近づけるなど工夫すべきでしょうか？ といいますのも、確かに、調べてみるとSDS sample bufferの組成については、ある程度の幅が許容されるようで、研究室内でもまずはそのままでいいんじゃないか、一方では還元剤などは良いとしても、塩濃度は調整しても良いのではとの意見があって、私は経験が浅いためどうしたものかと悩んでしまっています。 マーカーはDTTなしのものが研究室にあるため、それを使うと終濃度40mM程度でちょうど良いかなとは考えています。 どうか皆様のご経験やお考えをいただけましたらありがたいです。よろしくお願い致します。

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