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(無題) 削除/引用 No.4733-10 - 2016/01/12 (火) 14:21:14 - AA 一つの尺度として、 「増幅過程を含むか否か」 という基準が考えられうるかと思います。 こういうものを一般論化するのはあまり良くないかもしれないですが。。。

(無題) 削除/引用 No.4733-9 - 2016/01/12 (火) 01:25:10 - おお うらをかえせばwbでもduplicateとかしているひとも、サンプルサイズによってはいるとおもいます。でも1セットのデーターを提示すればいいだけの話なので、データーではあまりみないだけだとおもいます。

(無題) 削除/引用 No.4733-8 - 2016/01/11 (月) 23:52:00 - おお １つでどれくらいブレるか、どれくらい信用できるかでご自身が決めることかと思います。正確な値という観点なら３、４つで平均するほうが正確です。

(無題) 削除/引用 No.4733-7 - 2016/01/11 (月) 23:29:08 - くぁswでfrgthyじゅいこlp；＠ 別にそういう決まりがあるわけじゃないです。自分で大丈夫と思えば１つでもいいし、心配かなと思えば２〜４つでやればいいし。

(無題) 削除/引用 No.4733-6 - 2016/01/11 (月) 15:32:42 - 橋渡る APさん早速コメントいただきありがとうございます！！ なるほど、やはりウエスタンに比べて誤差が生じやすいから、というのが根拠だったんですね。 そう最初考えていただのですが、「う？でもウエスタンでも溶解やら遠心やらタンパク定量やらボイル、転写効率やら色々ファクターあるんちゃいますのん？」と心の中で思っていました。 ですが、APさんからのコメントはとても腑に落ちました。 初歩的な内容に関してコメントくださり、ありがとうございます。 次回、いくつか同じサンプルを作って同時に実験してみます。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.4733-5 - 2016/01/11 (月) 15:30:26 - AP 先輩が少なくとも一検体あたり２反応はしなきゃならないというのは、二つの値が一致していれば、まあその値を信じていいだろう、外れている場合は手技上の問題があってどちらが本当か（あるいは両方嘘か）はわからない、やり直しする必要があると判断できる、ということです。

(無題) 削除/引用 No.4733-4 - 2016/01/11 (月) 15:26:51 - AP >試しに、先輩の言うように同一サンプルで複数反応して反応ごとにどの程度、ブレるか見てみなさい たとえば、３反応してみると、二つはほぼ同値だけれどあとひとつはとんでもなく外れているということはよく経験することです。そういうときは外れている方は外れ値だと判断できますが、一反応しかしていないと、その外れた方の値が出ていてもそのまま受け入れることになりますよ。

(無題) 削除/引用 No.4733-3 - 2016/01/11 (月) 15:23:48 - AP いろいろ指摘する点はあるけれど、 第一にreal-time PCRは非常に鋭敏な方法であり（微量の標的を検出できる一方、ちょっとしたピペッティングの誤差やごく僅かなコンタミすら結果に影響を与えてしまう）、また実験系が適切であるか否かに関わらず、結果は数値化されて出てきます。電子天秤で質量を量るように、pHメーターでpHを測るように、数値で出てきた値を、そのまま簡単に信じてしまっていいものではないというのはわかりますね。ウェスタンでは正確な数値化はできないし、小さな差はそもそも見分けられません。 試しに、先輩の言うように同一サンプルで複数反応して反応ごとにどの程度、ブレるか見てみなさい。くわえて、鋳型なしのブランクをとる必要もあります（コンタミでブランクでポジティブにあることもよくあります）。また本当なら、同一条件で培養して、別個に準備した細胞からのcDNAでレプリケートを実行する必要があります（これが本当のレプリケートであり、同一サンプルを何度繰り返し測定したところで標本数n=1にしかならない）。

(無題) 削除/引用 No.4733-2 - 2016/01/11 (月) 15:13:08 - 橋渡る 読み返してみたらすごく分かりずらかったので、追記させてください。 私が行った定量PCRの4 wellsの内容 well#1:37度(HPRT用プライマー) well#2:42度(HPRT用プライマー) well#3:37度(HSP70用プライマー) well#4:42度(HSP70用プライマー) 先輩の指摘に従った場合の定量PCRの8 wellsの内容 well#1:37度(HPRT用プライマー) well#2:37度(HPRT用プライマー) well#3:42度(HPRT用プライマー) well#4:42度(HPRT用プライマー) well#5:37度(HSP70用プライマー) well#6:37度(HSP70用プライマー) well#7:42度(HSP70用プライマー) well#8:42度(HSP70用プライマー) どちらでやるべきなんでしょうか？ もちろんduplicateでやったほうが信頼度は高いとは思いますが・・

ウエスタンはよくて、定量PCRはdupliじゃないとだめか？ 削除/引用 No.4733-1 - 2016/01/11 (月) 15:08:36 - 橋渡る 橋渡るといいます。 実験の捉え方に関して疑問があるので教えて下さい。 現在、細胞からRNAを抽出し、cDNAを合成したのち、Bio-Radの機器で定量RT-PCRを行いました。細胞は42度でヒートショック処理の有無の２つのサンプルのみ（cDNAも当然２つ）です。 ハウスキーピング遺伝子用にHPRTを、HSP70をみたい遺伝子（というより今回ではポジコンですが）として実験を設計したいです。 そこでBio-Radの96-well plateの4-wellsに次のようにサンプルを投入しました。 well#1:37度(HPRT用プライマー) well#2:42度(HPRT用プライマー) well#3:37度(HSP70用プライマー) well#4:42度(HSP70用プライマー) そうしたら、先輩から「ふっ、一つのサンプルにたいして一つしか測定しないのか？せめてduplicateじゃなきゃ信用できないでしょ」みたいなことを言われました。 ただ、先日SDS-PAGEを行い、ポンソー染色や抗HSP70抗体を使ってウエスタンをしたところきちんとHSP70の爆発的な誘導が認められた（ポンソー染色でも見えるほどに）んですが、このウエスタンは一つのタンパク質サンプルは一つのレーンにしか流してないです。 先輩の考えが正しければ、ウエスタンでも同じサンプルをduplicateかそれ以上で流すべきなんじゃないのかな？と思えてきました。（そんな人をやってる人は私はみたことないですし、定量PCRではduplicateで行ってる人が多く知り合いにいることも知っています。） 先輩の考えは矛盾していないか？と問いたいわけではなく、なぜウエスタンではよくて、定量PCRではduplicateでやるのか、腑に落ちる考えかたがありましたら、教えて下さい。 すごく初歩的な内容で申し訳ないです。

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