Bio Technical フォーラム

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リアルタイムPCRの手技 トピック削除
No.4754-TOPIC - 2016/01/16 (土) 16:26:00 - お
いつも勉強させていただいております。

リアルタイムPCRを始めたのですが、シグナルが全く増幅しなくなり困っています。
色素はSYBR GREENを使っています。cDNA溶液は４度で保存しており分解の心配はありません。プライマーも一度しっかりシグナル増幅が確認できたものを使っているのであってないことはないです。検出系についても問題がないことは確認しました。
考えられる原因がもう自分の手技しかなく困っています。同じ実験をされる方が同じ研究室にはいないので注意すべき点がについて思い当たる方がいらっしゃればぜひご意見お願いします。
　
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No.4754-7 - 2016/01/19 (火) 11:06:10 - お
>[Re:5] おおさんは書きました :
> ポジコンはなにつかってるんでしょうか。１tubeでRTPCRができるようなものでは毎回RNAからスタートですよね。そういう場合はRNAが分解してしまっているかもしれませんよ。
RNAの分解ですか…確かめてみます。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用
No.4754-6 - 2016/01/19 (火) 11:04:01 - お
>[Re:4] HIHさんは書きました :
> 頼みにくいかもしれませんが、その他研究室の方に一度自分の手技を見てもらうのが一番確実です。
>
> PCRは意外と手技によって増幅効率に差が出るので…（結果は一緒でも）
>
> 基本的な心掛けは「よく混ぜる」「早くする」だと思いますが。
>
> ただ全く増幅しないというのは根本的なミスがどこかにある気もします。
> なので見てもらってそれを探す方が良い気がします。

前お願いしたときに一緒に見てもらい問題なさそうとは言われました。
よく混ぜる早くするに気をつけてやってみます。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用
No.4754-5 - 2016/01/19 (火) 10:09:02 - おお
ポジコンはなにつかってるんでしょうか。１tubeでRTPCRができるようなものでは毎回RNAからスタートですよね。そういう場合はRNAが分解してしまっているかもしれませんよ。

(無題) 削除/引用
No.4754-4 - 2016/01/18 (月) 08:55:27 - HIH
頼みにくいかもしれませんが、その他研究室の方に一度自分の手技を見てもらうのが一番確実です。

PCRは意外と手技によって増幅効率に差が出るので…（結果は一緒でも）

基本的な心掛けは「よく混ぜる」「早くする」だと思いますが。

ただ全く増幅しないというのは根本的なミスがどこかにある気もします。
なので見てもらってそれを探す方が良い気がします。

(無題) 削除/引用
No.4754-3 - 2016/01/17 (日) 11:17:45 - お
>[Re:2] HIHさんは書きました :
> まず絶対に増えるポジティブコントロールを用意するべきでしょう。
> それで反応が見られないなら水やプライマー、酵素などの試薬の問題でしょう。
> 一応機械の不調や試薬の問題なども考えて、普通のPCRでの確認も行えばプライマーの問題なども見えてくるでしょう。
>
> 色々な可能性があるのでリアルタイムPCRでなくても基本的なPCRのトラブルシューティングをやればいいかと思いますが。

うまく行かなくなってからはポジティブコントロールでしかやっていない状況です。
おなじ機械を使う他研究室の方にお願いして全く同じ試薬・水・鋳型をプレートにのせてもらったところ増幅できていたので私の調整方法が原因だろうと考えたのですが、ピペッティングの不足ややり方などでこんなに変わるものなのでしょうか・・。

(無題) 削除/引用
No.4754-2 - 2016/01/17 (日) 09:55:00 - HIH
まず絶対に増えるポジティブコントロールを用意するべきでしょう。
それで反応が見られないなら水やプライマー、酵素などの試薬の問題でしょう。
一応機械の不調や試薬の問題なども考えて、普通のPCRでの確認も行えばプライマーの問題なども見えてくるでしょう。

色々な可能性があるのでリアルタイムPCRでなくても基本的なPCRのトラブルシューティングをやればいいかと思いますが。

リアルタイムPCRの手技 削除/引用
No.4754-1 - 2016/01/16 (土) 16:26:00 - お
いつも勉強させていただいております。

リアルタイムPCRを始めたのですが、シグナルが全く増幅しなくなり困っています。
色素はSYBR GREENを使っています。cDNA溶液は４度で保存しており分解の心配はありません。プライマーも一度しっかりシグナル増幅が確認できたものを使っているのであってないことはないです。検出系についても問題がないことは確認しました。
考えられる原因がもう自分の手技しかなく困っています。同じ実験をされる方が同じ研究室にはいないので注意すべき点がについて思い当たる方がいらっしゃればぜひご意見お願いします。
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