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(無題) 削除/引用 No.4755-5 - 2016/01/17 (日) 16:48:13 - mon 最近、高価なのが難点ですが、浮遊培養系の293細胞やCHO細胞の一過性発現用の培地と導入試薬のセットが販売されましたので、あれこれ悩むよりそれらの使用が早道かも。。。

(無題) 削除/引用 No.4755-4 - 2016/01/17 (日) 16:45:03 - mon どの程度の収量を期待しているかもにもよります。 血清由来IgGが気になるならSuper Low IgG FBSを使うのも手です。 ttp://gelifesciences.co.jp/catalog/39463.html なお、protein Aを使うと牛IgGに対する親和性が低いので、目的Fc融合タンパクを優先的に精製できるかもしれません。ただし発現した目的タンパク含量が少ないと効果的ではないので注意してください。 OptiMEMはアミノ酸含量が少ないため大量発現には向いていませんが、一般的に栄養源としてTC Yeastolate（もしくはYeast Extract)を添加すると収量が増加します（培養期間も長め）。 CHO細胞用ですがBD Recharge（あるいはBD Resurge 1~5）も販売されています。 YeastolateとBD Rechargeは293細胞でも発現量が増えました。条件を振って調べていませんが、1.5~3倍程度になりました。OptiMEM+2%Super Low IgG+0.4% Yeastolate辺りがお手軽かも。 無血清培養について、OptiMEMはITSは含まれてるが脂肪酸が含まれていなかったと思いますので、Chemically Defined Lipid Concentrateを添加すると長期間の培養が出来るかもしれません。 ttps://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11905031 ただし無血清培養はdishから剥がれやすいので注意してください。 一過性発現の増強には、1~5mM程度のValproic acidの添加が有効です（ただし剥がれやすくなる）。CMVプロモーターは数uMのforskolinの添加も効果があるそうです。 CHO細胞になりますが、遺伝子導入後32℃で培養すると増殖が遅くなりますが分泌量は増大します。 なお、293細胞は低温培養の効果が無いようです。

(無題) 削除/引用 No.4755-3 - 2016/01/17 (日) 14:23:06 - おお プロテインGということなので、血清のIgGもひっかけるか、コンペティションになるか。。。そのあたりが気になります。

(無題) 削除/引用 No.4755-2 - 2016/01/17 (日) 14:17:27 - おお OPTI-MEMは無血清で維持するには不十分だった気がしますけど、、、培地を変えたときの持ち込みとかで持っているとか、、、 もし無血清ならFreeStyle™ 293 Expression Mediumとかありますけどね。 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/12338018

293TでFc融合分泌タンパク質の発現 削除/引用 No.4755-1 - 2016/01/17 (日) 13:35:13 - 293T お世話になります。 通常の293T細胞を利用して、Fc融合タンパク質を一過性に分泌させたいと思っています。 分泌させる際の培地に関して、２通りを考えており、皆様のご助言を賜ることができましたら幸いに存じます。分泌後の精製はプロテインGにて精製予定です。 1.　Nu-serumを加えた低血清OPTI-MEM1培地を用いる方法 2.　血清を入れず、OPTI-MEM1のみを用いる方法 先日２を試しましたが、きちんと分泌を確認できました。 2で上手く行くならわざわざ低血清培地を使うこともないんですが、使った方がよろしいでしょうか？ 回収量が大幅に上がるけど、血清由来の抗体が共精製されてしまう、なんてことがあるのでしょうか？皆様ならどちらの方法をとりますか？ OPTI-MEM1はラボに大量にあり、100mmディッシュを20枚ほど使って一度にトランスフェクションでもできないことはないです。どうでしょうか？

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